高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測大白菜中氰霜唑及其代謝物和氟啶胺的殘留

張愛娟，梁 林，馬新剛，劉 偉

(山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院/山東省化學(xué)農(nóng)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250033)

氰霜唑(cyazofamid)是新一代苯基咪唑類殺菌劑，對卵菌綱病原菌如疫霉菌、腐霉菌等具有很高的活性。已在我國大白菜、番茄、黃瓜、馬鈴薯、葡萄、西瓜等多種作物上取得登記。氰霜唑與植物病原菌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜結(jié)合，阻礙膜內(nèi)電子傳遞，干擾能量供應(yīng)，從而起到殺滅病原菌的作用。氰霜唑使用后會迅速分解成4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-腈(CCIM)、4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-甲酰胺(CCIM-AM)、4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-羧酸(CCTA)等多個(gè)代謝產(chǎn)物[1]。CCIM是氰霜唑在植物體內(nèi)的主要降解產(chǎn)物，與氰霜唑相比具有更高的毒性[2]。

氟啶胺(fluazinam)是日本石原產(chǎn)業(yè)自主研發(fā)生產(chǎn)的2，6-二硝基苯胺類低毒、廣譜性殺菌劑[3]。已在我國大白菜、番茄、黃瓜、辣椒、馬鈴薯等多種作物上取得登記。對食植性螨類和十字花科植物根腫病具有良好的防效[4～5]。但其環(huán)境毒性令人擔(dān)憂，有研究表明，氟啶胺可引發(fā)哮喘病和皮炎等破壞人免疫系統(tǒng)的疾病[6]。

目前，國內(nèi)外對氰霜唑的殘留分析主要采用LC-MS/MS法，LC-DAD法和電化學(xué)法，這些方法大多僅建立了氰霜唑母體的分析方法而不包括代謝物CCIM[7～10]。朱光艷等[11]對氰霜唑及其代謝物在葡萄和土壤中的殘留規(guī)律進(jìn)行了研究；張翠芳等[12]對氰霜唑及其代謝物在黃瓜和土壤中的殘留分析方法進(jìn)行了研究，但未見氰霜唑及其代謝物在大白菜中殘留分析方法的研究。

國外有文獻(xiàn)報(bào)道，用氣相色譜配氮磷和質(zhì)譜檢測器檢測葡萄和葡萄酒中的氟啶胺[13～15]。國內(nèi)有關(guān)氟啶胺的殘留分析主要有氣相色譜法檢測辣椒和馬鈴薯中氟啶胺的殘留[16～17]。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測馬鈴薯中氟啶胺的殘留[18～19]；李冠華等[20]采用高效液相色譜法測定了大白菜和土壤中氟啶胺的殘留，但樣品前處理繁瑣，有機(jī)溶劑用量大。

本文采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀結(jié)合QuEChERS方法，建立了大白菜中氰霜唑及其代謝物(CCIM)和氟啶胺的殘留量分析方法，該方法前處理簡便、定性定量準(zhǔn)確、分析方法快速、結(jié)果重現(xiàn)性好，可為開展氰霜唑和氟啶胺在大白菜上的風(fēng)險(xiǎn)評估及其安全使用研究提供檢測依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Aglient 1290Ⅱ-6460)，Aglient公司；渦旋儀(QL-861)，江蘇海門其林貝爾儀器制造公司；電子天平(JA21002)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)(TDL-5-A)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

氯化鈉、無水硫酸鎂、甲酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，賽默飛世爾科技公司；分析純，科密歐化學(xué)試劑有限公司)；C18吸附劑、N-丙基乙二胺吸附劑(PSA)和石墨化碳黑(GCB)(天津艾杰爾公司)；氰霜唑標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99.5%，購自Dr.Ehrenstorfer GmbH)，CCIM標(biāo)準(zhǔn)品(純度為95%，由中國科學(xué)院動物研究所提供)，氟啶胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99.0%，購自Dr. Ehrenstorfer GmbH)。

溶液配制：準(zhǔn)確稱取0.050 4g氰霜唑標(biāo)準(zhǔn)品至50mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容得1 003mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液；準(zhǔn)確稱取0.052 6 gCCIM標(biāo)準(zhǔn)品至50mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容得1 000mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液；準(zhǔn)確稱取0.038 8g氟啶胺標(biāo)準(zhǔn)品至50mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容得772mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。置于-20℃冰箱中保存，使用時(shí)再用乙腈稀釋成氰霜唑(10mg/L)、CCIM(10mg/L)和氟啶胺(20mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 大白菜前處理方法 準(zhǔn)確稱取搗碎的大白菜樣品10.0g于50mL具塞離心管中，加入10mL乙腈，渦旋1min，加入4g氯化鈉，劇烈振蕩1min，4 000r/min離心5min。取1mL上層清液轉(zhuǎn)移至加有50mg C18填料和50mg無水硫酸鎂的2mL離心管中，渦旋1min，靜置后，上清液過0.22μm有機(jī)濾膜，待測。

1.3 色譜條件 色譜柱：Eclispe plus C18.RRHD色譜柱(50mm×2.1mm，1.8μm)；流動相：乙腈+0.1%甲酸水溶液體積比70：30；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣體積：2μL；柱溫：室溫。

質(zhì)譜，干燥氣(氮?dú)?流速：11L/min；霧化氣壓力：15 Psi；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；干燥器溫度：300℃；毛細(xì)管電壓：4kv；碰撞氣：氮?dú)狻Ｔ诜治鲞^程中，以保留時(shí)間和離子對(母離子和2個(gè)子離子)信息比較進(jìn)行定性分析，以母離子和響應(yīng)最高的子離子進(jìn)行定量分析(表1)。

表1 氰霜唑、CCIM和氟啶胺質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的確定 分別用10mg/L的氰霜唑、CCIM標(biāo)準(zhǔn)溶液，在電噴霧電離ESI(+/-)方式下進(jìn)行全掃描(m/z50～500)，以選擇適當(dāng)?shù)姆肿与x子峰和電離方式。結(jié)果表明在正離子采集模式下氰霜唑[M+1]峰(m/z324.9)為最強(qiáng)峰，CCIM[M+1]峰(m/z217.9)為最強(qiáng)峰。選擇母離子進(jìn)行子離子掃描，通過進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量，碎裂電壓等參數(shù)，分別獲得氰霜唑定量離子對m/z324.9>108.0和定性離子對m/z324.9>260.9，相應(yīng)的碰撞能量分別為10V和6V，碎裂電壓105V；CCIM定量離子對m/z217.9>182.9和定性離子對m/z217.9>139.0，相應(yīng)的碰撞能量分別為18V和24V，碎裂電壓120V。

用10mg/L的氟啶胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在電噴霧電離ESI(+/-)方式下進(jìn)行全掃描(m/z50～600)，以選擇適當(dāng)?shù)姆肿与x子峰和電離方式。結(jié)果表明在負(fù)離子采集模式下[M-1]峰(m/z462.8)較正離子采集模式下[M+1]峰(m/z464.8)響應(yīng)高。選擇m/z462.8作為母離子進(jìn)行子離子掃描，通過進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量，碎裂電壓等參數(shù)，分別獲得定量離子對m/z462.8>415.9和定性離子對m/z462.8>369.8，相應(yīng)的碰撞能量分別為20V和35V，碎裂電壓100V。

色譜條件，試驗(yàn)表明乙腈+0.1%甲酸水作為流動相，流速為0.3mL/min，乙腈+0.1%甲酸水溶液體積比為70：30時(shí)，有效成分與雜質(zhì)能得到很好的分離，峰型對稱，基線平穩(wěn)。標(biāo)樣色譜圖(圖1)。

圖1 溶劑標(biāo)樣色譜圖(氰霜唑及CCIM 0.1mg/L氟啶胺0.2mg/L)

2.2 前處理方法摸索 分別選用PSA、石墨化炭黑(GCB)和C18作為凈化劑，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PSA、C18和GCB對氰霜唑沒有明顯吸附，PSA和GCB對氟啶胺大約有30%左右的吸附，GCB對CCIM的吸附達(dá)到90%以上，PSA對CCIM的吸附大約有50%。綜合結(jié)果分析最終選定C18為凈化劑，C18能較好的去除大白菜中的干擾雜質(zhì)，取得良好的凈化效果。

2.3 氰霜唑、CCIM、氟啶胺線性關(guān)系 將氰霜唑(10mg/L)、CCIM(10mg/L)和氟啶胺(20mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液用乙腈依次稀釋配的1、0.5、0.1、0.05、0.01mg/L(氰霜唑、CCIM)；2、1、0.2、0.1、0.02mg/L(氟啶胺)的系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。按1.4色譜條件進(jìn)樣，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3次，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與定量離子對峰面積做標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系良好。CCIM線性方程Y=5 817.2X+67.7，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 7；氰霜唑線性方程Y=17 327.0X+139.8，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 8；氟啶胺線性方程Y=1 128.9X+216.4，相關(guān)系數(shù)(r)為0.990 9。

2.4 氰霜唑、CCIM、氟啶胺添加回收率和精密度 在空白大白菜中按照0.01、0.1、1mg/kg水平添加氰霜唑及CCIM標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照0.02、0.2、2mg/kg水平添加氟啶胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度5次平行試驗(yàn)，進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。結(jié)果表明(表2)：在0.01～1mg/kg添加水平范圍內(nèi)，氰霜唑及其代謝物(CCIM)在大白菜中平均添加回收率分別為93.6%～97.2%和87.3%～103.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.4%～10.6%和2.6%～4.5%。在0.02～2mg/kg添加水平范圍內(nèi)，氟啶胺在大白菜中平均添加回收率為95.0%～108.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.4%～5.8%，符合農(nóng)藥殘留分析要求。目標(biāo)峰無雜質(zhì)干擾，峰型好(圖2)。

2.5 方法檢出限、定量限 以最小線性濃度按照3倍信噪比計(jì)算得出氰霜唑、CCIM和氟啶胺的最小檢出量(LOD)分別為5.3×10-5ng、1.9×10-4ng和9.2×10-4ng，以最小添加水平作為方法的定量限(LOQ)，大白菜中氰霜唑和CCIM的最低檢出濃度均為0.01mg/kg;氟啶胺的最低檢出濃度為0.02mg/kg。

表2 大白菜中氰霜唑、CCIM和氟啶胺的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖2 大白菜中添加色譜圖(氰霜唑及CCIM 0.1mg/kg氟啶胺0.2mg/kg)

3 結(jié)論

本文采用QuEChERS方法提取、凈化、LC/MS/MS法快速檢測大白菜中氰霜唑及其代謝物(CCIM)和氟啶胺的殘留分析方法，樣品經(jīng)乙腈提取，C18凈化，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。氰霜唑、CCIM在大白菜中的最低檢測濃度為0.01mg/kg，氟啶胺在大白菜中的最低檢測濃度為0.02mg/kg，平均回收率在87.3%～108.1%之間。該方法具有重現(xiàn)性好，簡單、高效、低成本等特點(diǎn)，能夠滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，同時(shí)也可為其他農(nóng)產(chǎn)品及食品中氰霜唑及氟啶胺的殘留檢測提供參考依據(jù)。