高遷移率族蛋白B1在正常C57BL/6J小鼠耳蝸組織中的分布

方佳 邢雅智 陳衡超 殷善開 時海波 蘇開明

上海交通大學附屬第六人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科（上海200233）

上海交通大學耳鼻咽喉科研究所（上海200233）

高遷移率族蛋白B1（High mobility group box 1，HMGB1），作為一種高度保守的核內非組蛋白DNA結合蛋白，在真核細胞中表達豐富。它由215個氨基酸殘基組成，其分子量約為25kDa。它能夠被活化細胞主動分泌或被死亡細胞被動釋放，并在細胞內外微環境中發揮重要作用[1]。HMGB1通過多種受體參與各種疾病的發生發展，尤其在晚期糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation end-products，RAGE)和 Toll樣受體家族(toll-like family of receptors，TLRs)中研究較多[2-4]。多種研究表明HMGB1參與多種疾病的發病機制，其中包括膿毒癥[5,6]，缺血再灌注損傷（肺、腦、脊髓、腎）[7-10]，急性肝衰竭[11]，急性壞死性胰腺炎[12]，糖尿病[13]，動脈粥樣硬化[14]，神經退行性疾病[15,16]以及腫瘤的發生發展中[17-19]等。HMGB1的分子信號通路尚未被完全闡明，而目前在耳科領域中HMGB1的研究較少，同時HMGB1與噪聲性聾及藥物性耳毒性及其他因素所致耳毒性關系也有待進一步研究。Ladrech團隊分別于2013年和2017年對急性大劑量阿米卡星的耳毒性進行研究，他們初步探討了Deiters細胞、上皮細胞、SGNs細胞通過HMGB1與不同下游信號通路在藥物性耳毒性中可能發揮了重要作用[20,21]。在各種因素所致的耳毒性中不同細胞通過不同的微觀分子變化參與內耳損傷的調節機制是不同的，我們猜測在生理情況下某些分子的基礎水平可能存在細胞間的差異，進而在內耳疾病的發生發展中其與疾病的相關性存在差異，因此，研究HMGB1在耳蝸內的生理分布很有必要。

本研究中，我們選取4-6w聽力正常的C57BL/6J小鼠為實驗對象，運用全耳蝸基底膜鋪片及冰凍切片，并行免疫熒光染色，觀察HMGB1在Corti氏器及螺旋神經節區頂底回之間的分布情況，并定量分析HMGB1在各細胞中的差異，為研究HMGB1在內耳疾病中的作用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

4-6周齡SPF級C57BL/6J小鼠10只，耳廓反應靈敏，無中耳炎及其他耳部疾病。實驗動物由上海市第六人民醫院實驗動物中心供應。飼養環境背景噪聲小于50 dB SPL。

1.1.2 實驗試劑

兔單克隆抗體抗HMGB1（1∶200；Abcam）；鼠單克隆抗體抗神經絲蛋白-200（NF-200）（1∶200；Sigma）；鼠單克隆抗體抗SOX-2（1∶200；Abcam）；羊抗鼠IgG1（y1）二抗（1∶800；Invitrogen）；羊抗兔IgG二抗（1∶800；Invitrogen）；羅丹明-鬼筆環肽phalloidin（1∶200；Sigma）；Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚；1%；Solarbio）；封閉液BSA（5%；Solarbio）；DAPI封片液（Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 開放聲場ABR測聽

采用TDT測聽設備（Tucker-Davis Technologies；美國），在隔聲屏蔽室內對小鼠進行ABR閾值測試。使用氯胺酮（100 mg/kg）和賽拉嗪（15 mg/kg）的混合液對小鼠進行麻醉（腹腔注射）。進入深度麻醉后，將記錄電極置于小鼠雙側耳廓前緣連線中點皮下，雙側耳后皮下分別放置參考電極及接地電極。揚聲器距小鼠雙耳約10 cm。刺激聲采用短聲（Click；給聲頻率21.1/s，時程0.1 ms，采樣率200 kHz）和短純音（Tone burst；給聲頻率21.1/s，上升/下降時間 0.5 ms，時程 10 ms，采樣率 200 kHz）。ABR誘發電位經前置放大器RA16放大20倍后采集（帶通濾波300～3000 Hz，疊加次數1000次，采樣率25 kHz）。刺激聲強度自90 dB SPL開始，以5 dB逐漸遞減，直至ABR波形中III波的消失前的最后一個強度作為小鼠的聽閾。

1.2.2 耳蝸基底膜鋪片及耳蝸冰凍切片

動物過量麻醉后斷頭，取出聽泡，并移至解剖顯微鏡下。用解剖針開放圓窗和卵圓窗，在蝸尖鉆孔，并經此孔灌流4%多聚甲醛，4℃固定2 h后放入10%EDTA溶液中脫鈣6-12 h。用于基底膜鋪片的耳蝸，則轉移至PBS溶液中，剝去其蝸殼，去除前庭膜及蓋膜，切除螺旋韌帶。用于冰凍切片的耳蝸則經15%、30%蔗糖，以及30%蔗糖和OCT溶液1∶1混合液梯度脫水后，將其置于OCT溶液進行包埋。在冰凍切片機中切取耳蝸中軸切片，將其迅速貼于載玻片上，室溫晾干后-20℃冰箱保存。

1.2.3 免疫熒光染色

耳蝸基底膜免疫熒光染色：將分離好的基底膜置于1%Triton X-100室溫中1 h后，PBS漂洗，5%BSA室溫封閉1 h，加HMGB1抗體4℃搖床孵育18 h，PBS漂洗，加二抗，室溫孵育2 h，PBS漂洗。加入phalloidin室溫孵育20 min，PBS漂洗。載玻片上滴加DAPI后封片。

耳蝸冰凍切片免疫熒光染色：取出小鼠耳蝸切片，室溫晾干，PBS溶解洗去剩余OCT，抗原修復液室溫孵育半小時，1%Triton X-100室溫孵育40 min，PBS漂洗，之后5%BSA室溫封閉1 h，加一抗（HMGB1、SOX-2、NF-200抗體）4℃搖床孵育18 h，PBS漂洗，加二抗，室溫孵育2 h，PBS漂洗。載玻片上滴加DAPI后封片。

1.2.5 圖像采集及定量分析

采用激光共聚焦顯微鏡（Zeiss710，德國）觀察并記錄全耳蝸基底膜鋪片及冰凍切片染色情況。利用ZEN2011（blue edition）軟件分別對各區域的細胞采取熒光密度定量計數。分別選取6個不同小鼠的樣本的冰凍切片共聚焦成像，然后用blue edition軟件分別在每個樣本各區域共選取5個不同的細胞，分別勾畫出選定的Corti氏器的內毛細胞、外毛細胞和Deiter cells以及螺旋神經節區的螺旋神經節細胞和膠質細胞區域，然后用軟件自帶的熒光密度計算給出的HMGB1通道的熒光密度平均灰度值（Gray），最后做統計學分析。

1.2.6 統計

GraphPad Prism 5.0做圖，SPSS 20.0做數據的統計學分析，統計學分析采用單因素方差分析（one-way ANOVA）及獨立樣本t檢驗（independent-samples T test），數據以平均值i標準誤（xi SEM）表示，P＜0.05代表差異具有統計性意義。

2 結果

HMGB1在小鼠耳蝸頂底回Corti氏器內毛細胞、外毛細胞及Deiters cells的熒光密度灰度值（x i SEM）分別為49.61i 0.97、12.14i 0.99、56.00i 4.20和50.77i 0.72、10.29i 1.39、59.70i 3.14。其中頂底回Corti氏器內毛細胞（t=0.966，P=0.340）、外毛細胞（t=0.994，P=0.327）、Deiters cells（t=0.521，P=0.606）均無統計學差異，但頂底回Corti氏器內各細胞熒光密度為Deiters cells多于內毛細胞多于外毛細胞，HMGB1的表達具有明顯差異（頂回：F=92.64，P＜0.01；底回：F=185.65，P＜0.01）。小鼠耳蝸頂底回的螺旋神經節細胞HMGB1熒光密度分別為72.58i 5.92和73.46i 5.16，分布無明顯差異（t=0.113，P=0.911），但HMGB1在螺旋神經節區膠質細胞頂底回的熒光密度分別為66.35i 4.27和78.81i 4.31，具有差異性（t=2.034，P=0.048）（圖2）。頂底回螺旋神經節區內部膠質細胞與螺旋神經節細胞HMGB1分布均無明顯差異（頂回：t=0.854，P=0.399；底回：t=0.795，P=0.431）

HMGB1在小鼠耳蝸內Corti氏器、螺旋神經節區及血管紋區均有表達（圖2）。小鼠全耳蝸基底膜鋪片各回中的HMGB1均以核內表達為主（圖3）。在Corti氏器各細胞中，Deiters cells和內毛細胞HMGB1分布更多（圖4）。小鼠耳蝸頂底回螺旋神經節區HMGB1主要分布于細胞核內，其中頂底回間螺旋神經節細胞無明顯差異，而底回膠質細胞HMGB1的表達與頂回相比更豐富（圖5）。

圖1 HMGB1在Corti氏器和螺旋神經節區的熒光密度統計學分析。可見，耳蝸頂回和底回Corti氏器及螺旋神經節細胞HMGB1表達均無明顯差異，且各回螺旋神經節區螺旋神經節細胞與膠質細胞HMGB1分布無明顯差異，但頂底回Corti氏器內各細胞HMGB1的表達具有明顯差異，并且頂底回膠質細胞存在顯著差異。A圖示頂回Corti氏器各細胞之間的統計學差異，底回Corti氏器各細胞的統計學差異同頂回，圖中未標。其中*代表P ＜ 0.05，**代表P ＜ 0.01。Fig.1 Statistical analysis of the intensity mean value of HMGB1 in the organ of Corti and spiral ganglion area.Apparently,there has no difference between the apical and basal turn in the organ of Corti and spiral ganglion cells.Also,there has no difference between spiral ganglion cells and glial cells in apical or basal turn.However,there has a statistical difference between the Deiters cells,the inner hair cells and the outer hair cells in the organ of Corti.Besides,there has a difference between the apical and basal turn in glial cells.A shows the the statistical difference between the cells in the apial turn of the Corti's apparatus.The statistical difference between the cells in basal turn is the same as in the apical turn,and it is not marked above.Significance of one-way ANOVA and independent-samples T test,*P＜0.05,**P＜0.01.

圖2 低倍鏡下，HMGB1在正常小鼠耳蝸中的表達分布。正常C57BL/6J小鼠耳蝸中軸切面中可見Corti氏器、螺旋神經節區及血管紋區均有HMGB1表達。A中藍色熒光為標記細胞核DNA的DAPI，B中綠色熒光為標記HMGB1蛋白，C中紅色熒光為標記支持細胞的SOX-2蛋白，D為DAPI、HMGB1和SOX-2的疊加成像。Fig.2 The distribution of HMGB1 in mouse cochlea at low magnification.HMGB1 was expressed in the organ of Corti and spiral ganglion area and stria vascularis in the axial section of the cochlea in C57BL/6J mice.A,B,C labeled with DAPI,HMGB1 and SOX-2 respectively.D represented the merged images.

圖3 高倍鏡下，HMGB1在正常小鼠耳蝸基底膜鋪片中底回毛細胞的表達分布。正常C57BL/6J小鼠耳蝸底回基底膜的內外毛細胞均有HMGB1的表達，并且主要分布在核內。A中藍色熒光為DAPI，B中綠色熒光為標記HMGB1，C中紅色熒光為標記F-Actin微絲蛋白的Phalloidin，D為DAPI、HMGB1和Phalloidin的疊加成像。Fig.3 The expression of HMGB1 in the hair cells of basal turn in normal mice under high magnification.HMGB1 was detected in the nuclei of the inner and outer hair cells.A,B,C labeled with DAPI,HMGB1 and Phalloidin respectively.D represented the merged images.

圖4 HMGB1在小鼠耳蝸頂回(A和B)和底回(C和D)Corti氏器的表達分布。A和C為HMGB1。B和D分別代表DAPI、HMGB1和phalloidin疊加圖像。正常小鼠Corti氏器頂底回間無明顯表達差異。其中，內毛細胞(星號)和Deiters細胞(三角形)的HMGB1表達較外毛細胞(箭頭)更豐富，但也主要分布于細胞核內。Fig.4 The distribution of HMGB1 in the organ of Corti.A,B was from the apical turn,and C,D was from the basal turn.A,C labeled with HMGB1.B and D represented the merged images.The expression of HMGB1 had no difference between the apical and basal turn.The HMGB1 in inner hair cells(asterisk)and Deiters cells(arrowhead)was more abundant than that in outer hair cells(arrow),mainly distributing in the nuclei.

圖5 HMGB1在正常小鼠耳蝸底回螺旋神經節區的表達分布。HMGB1在頂底回螺旋神經節細胞中主要分布在細胞核內（A、E），分布無明顯差異。膠質細胞HMGB1（I、M）在耳蝸頂底回之間存在差異。其中D和H分別為頂回和底回螺旋神經節區螺旋神經節細胞的放大圖，L和P分別為頂回和底回螺旋神經節區膠質細胞放大圖。其中D、H、L、P分別為A、E、I、M中選定區域的放大圖。Fig.5 The expression of HMGB1 in Rosenthal’s canal.HMGB1 mainly distributed in the nuclei of the spiral ganglion neurons(A、E represent the expression of HMGB1 in apical and basal spiral ganglion cells.There is no difference).Apparently,the HMGB1 in basal glial cells(P)was higher than that in apical turn(L).

3 討論

HMG核蛋白家族是一組核染色質蛋白，于40年前被發現，因其在聚丙烯酰胺凝膠能快速電泳而被命名為高遷移率族[22]。這一非組蛋白、核染色質相關蛋白有相同的結構特性，主要參與到DNA的重組和轉錄調節中。HMGB1是HMG核蛋白家族中的一員，研究表明，HMGB1由A框、B框和C末端3個結構域構成，其中A框和B框是位于氨基端的兩個DNA結合結構域，C末端是一個高度重復并富含酸性氨基酸的區域，其可參與調節HMGB1與DNA結合的親和力[23]。在真核生物中，HMGB1位于大多數細胞的胞核和胞漿中，其中包括淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等組織。

HMGB1具有多樣的生物學效應。在正常細胞核中HMGB1主要起骨架蛋白作用，而在各種應激刺激下HMGB1則被分泌致胞質甚至胞核外，進而參與各種疾病的發生發展及轉歸過程中。研究表明，HMGB1既可以通過病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)參與病原體損傷組織和細胞，同時也可以損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)參與缺氧、應激等刺激因素所致的組織和細胞損傷中[24]。HMGB1不僅可以參與早期炎癥反應，亦可介導晚期炎癥反應，此外它還可介導多種免疫病理，并參與特異性免疫應答反應。而多種研究又表明感音神經性聾如噪聲性聾、老年性聾、突發性聾、感染性耳聾、自身免疫性內耳疾病等與局部或全身免疫反應及炎性反應密切相關，并且通過抗炎藥物及免疫抑制劑可有效治療免疫介導的感音神經性耳聾[25]。

隨著在多種疾病中均發現有HMGB1的參與，HMGB1作為一個治療靶目標的興趣也在逐漸增加。在不同的炎癥反應中有針對HMGB1的治療包括特異性的治療和非特異性的治療。其中特異性的抑制劑包括抗HMGB1抗體（Anti-HMGB1 antibodies）、重組 A 盒（HMGB1 A Box）和甘草甜素（Glycyrrhizin）。而非特異性的抑制劑包括可溶性RAGE（sRAGE）、丙酮酸乙酯（Ethyl pyruvate）、血栓調節蛋白（Thrombomodulin）、抗膽堿能類藥物和鉑酸鹽劑（Platinating agents）等。單克隆和多克隆HMGB1抗體可以直接結合HMGB1，阻斷HMGB1的作用，從而抑制鼠類非甾體抗炎藥（NSAID）誘導的結腸炎、出血性休克、博來霉素所致的肺纖維化等疾病[26-28]。重組A盒能對抗HMGB1的B盒，與HMGB1競爭受體的激活，可改善缺血性腦損傷的梗死范圍[29]。小分子甘草甜素與HMGB1有高親和力，可參與到包括蛛網膜下腔出血和脊髓損傷的神經保護作用中[30,31]。鉑酸鹽劑可抑制HMGB1從核內釋放[32]，使HMGB1穩定在核內，而丙酮酸乙酯和抗膽堿能藥物則可阻斷HMGB1釋放的信號通路[33,34]。這些動物實驗的探討研究為各種疾病的臨床試驗及臨床用藥指明了新的方向。

在本研究中，C57BL/6J小鼠耳蝸內Corti氏器及螺旋神經節區均有HMGB1的表達，但其主要分布于核內，這與以往文獻中報道的在其他細胞中HMGB1分布于胞核和胞質中但以胞核為主相符，故本實驗中各細胞胞質中HMGB1可能是其有少量表達。目前，HMGB1在正常動物耳蝸中的表達分布情況無文獻報道。在該實驗中，小鼠耳蝸內Corti氏器及螺旋神經節區均有HMGB1的表達，但其在耳蝸Corti氏器各細胞中的表達存在差異，其中Deiters cells多于內毛細胞多于外毛細胞。同時，本實驗還發現螺旋神經節區的膠質細胞在頂底回間存在差異。以往多種研究表明急性氨基糖苷類抗生素耳毒性主要與毛細胞凋亡相關，而慢性氨基糖苷類抗生素耳毒性主要與毛細胞壞死相關[35]。Sabine Ladrech團隊研究了在阿米卡星耳毒性中HMGB1在Deiters cells胞質中大量而暫時性的表達升高從而參與Corti氏器內皮細胞重建[20]，以及阿米卡星耳毒性中HMGB1可能參與到耳蝸SGNs早期存活機制中[21]。這些發現均可能與正常情況下耳蝸內細胞間的表達差異相關。并且氨基糖苷類所致的耳毒性可能與HMGB1參與凋亡壞死通路相關。因此，正常小鼠耳蝸內HMGB1的表達分布情況為HMGB1在內耳疾病中的作用機制研究提供基礎。目前在多種其他疾病中HMGB1作為一個治療靶目標已得到實驗確證，目前處于臨床試驗階段。因此今后我們將繼續研究與探討HMGB1及其特異性和非特異性藥物在多種內耳疾病中的作用，最終為內耳疾病的臨床治療提供更廣闊的選擇。