診斷性介入肺臟病學取材聯合病原微生物宏基因組測序在肺部感染應用的原則

吳波，馮靖，張靜，王家卉

肺部感染是全世界人口主要死亡原因之一［1］。然而，由于數百種病原體與肺部感染有關，包括細菌［2］、病毒［3］和真菌［4］，其診斷具有挑戰性。肺部感染的快速微生物學診斷有助于及時進行抗微生物病原體治療。 介入肺臟病學（interventional pulmonology，IP）作為一種依靠先進、安全的診斷和治療程序來管理良、惡性肺病的醫學專業，在肺部感染診斷方面發揮重要作用［5］。傳統病原微生物檢測技術如涂片和培養都相對不敏感，且檢驗過程耗時較長；組織病理學是診斷侵襲性真菌感染的金標準，然而它需要時間［6］。測序技術和生物信息學的快速發展使病原微生物宏基因組測序技術（microbial metagenomics sequencing，mMS）不斷成熟，mMS僅需從樣品中直接獲取少量遺傳物質并進行測序，通過將測序讀數與準確的參考基因組數據庫聯系起來即可鑒定病原體。診斷性介入肺臟病學（diagnostic interventional pulmonology，dIP）+mMS 技術有利于肺部感染病原微生物的診斷，提高診斷速度及敏感性。dIP+mMS應與傳統病原微生物檢測技術聯用且相互補足，而非替代傳統病原微生物檢測技術；同時應緊密結合臨床信息解讀mMS報告。

1 dIP+mMS的適用范圍

入院之初或疾病治療當中，如臨床及影像學提示可能為特殊的、不常見的病原，非一般社區獲得性感染，非常見院內獲得性感染，即應進行dIP+mMS，不必等到臨床長時間反復治療效果不佳時；初步經驗性治療反應不佳，且傳統病原微生物檢測陰性，針對性治療難以進行；免疫缺陷患者，出現呼吸道癥狀或影像學變化，提示肺部感染時，經驗性治療同時即應盡快安排dIP+mMS；感染造成的呼吸危重癥患者，應盡快安排dIP+mMS；影像學提示肺部病灶，但需啟動可能造成較重免疫缺陷的治療，需除外感染時；流行病學調查等，需非常明確的病原分型，需精確至種，甚至要求明確病原基因型時；其他需明確病原或除外感染的情況。

2 dIP+mMS的常用取材方式

2.1 經支氣管肺活檢（transbronchial lung biopsy，TBLB） 影像學提示病灶較明確，TBLB可取得代表性病灶的，經快速現場評價（rapid on site evaluation，ROSE）確認，TBLB 組織粒送檢dIP+mMS；若考慮存在非感染性病灶可能，TBLB 可取得代表性病灶的，經ROSE確認，TBLB組織粒送檢dIP+mMS并組織病理學檢查以排除感染；單靶部位單次送檢不少于2粒組織粒。

2.2 經支氣管刷檢（transbronchial brushing，TBBr） 影像學提示病灶較明確，馮氏二級防污染毛刷和封堵超細針刷TBBr 可刷經代表性病灶的，TBBr 刷頭送檢dIP+mMS；TBBr 不可刷經代表性病灶，但可刷經代表性病灶上級引流氣道的，TBBr 刷頭也可送檢dIP+mMS，但效果較之可直接刷經代表性病灶的差；單靶部位單次送檢不少于1枚刷頭。

2.3 支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage，BAL） 影像學提示病灶較明確，BAL可灌及代表性病灶的，支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）送檢dIP+mMS；BAL 不可灌及代表性病灶，但可灌及代表性病灶上級引流氣道的，BALF 也可送檢dIP+mMS，但效果較之可直接灌及的差；單靶部位單次送檢BALF不少于3 mL。

3 dIP+mMS常用不同取材方式的合理選擇

TBLB所取組織粒代表肺部1個或數個取材點，如獲得代表性病灶，其內含高濃度病原，敏感度、特異度均較好。因鉗杯內相對隔離，屬于保護性取材，如獲得代表性病灶，易于區分感染或是定植。對于ROSE 可見病原與非感染性病灶可較好地借助ROSE 優勢。對于非感染性病灶可較好地借助組織病理學優勢。對組織深在病原感染，如耶氏肺孢子菌感染后期、巨細胞病毒感染等，易于區分感染或是定植。涉及范圍僅為1 個或數個取材點，如不能獲得代表性病灶，可致假陰性。出現操作相關并發癥如出血、氣胸等的可能性高于TBBr和BAL。對術者與助手操作技術與經驗的要求遠高于TBBr與BAL。

TBBr 所取刷頭代表肺部1 條或數條取材線，如刷經代表性病灶，其內含較高濃度病原，敏感度、特異度均好于BAL但遜于TBLB；采用馮氏二級防污染毛刷與針刷刷經代表性病灶，屬于保護性取材，易于區分感染或是定植；可一定程度上借助ROSE優勢，尤其是對于ROSE 可見病原與非感染性病灶，但無論制片與判讀效果均明顯遜于TBLB；不能借助組織病理學優勢，尤其是對于非感染性病灶；對組織深在病原感染，如耶氏肺孢子菌感染后期、巨細胞病毒感染等，敏感度、特異度均好于BAL但遜于TBLB；涉及范圍為1 條或數條取材線，明顯廣于TBLB 但少于BAL，如不能刷經代表性病灶或代表性病灶上級引流氣道，可致假陰性；出現操作相關并發癥如出血、氣胸等的可能性明顯低于TBLB，但高于BAL；對術者與助手操作技術與經驗的要求遠低于TBLB，但高于BAL。

BALF代表肺部1個或數個取材扇或取材團，如灌及代表性病灶，其內可含一定濃度病原，但敏感度、特異度均遜于TBLB和TBBr；含口腔與主氣道雜菌較多，污染較重，極易混淆，不易區分感染或是定植；不能借助ROSE 優勢，尤其是對于ROSE 可見病原與非感染性病灶；不能借助組織病理學優勢，尤其是對于非感染性病灶；對組織深在病原感染，如耶氏肺孢子菌感染后期、巨細胞病毒感染等，敏感度、特異度均遜于TBLB 和TBBr，但對于氣道和肺泡表面病原，如活動性肺結核、耶氏肺孢子菌感染早期，部分巨細胞病毒感染，則具較好的敏感度與特異度；涉及范圍為1 個或數個取材扇或取材團，明顯廣于TBLB 與TBBr，容易包括代表性病灶或代表性病灶上級引流氣道，不易遺漏病灶位置；出現操作相關并發癥如出血、氣胸等的可能性較低；易于操作，對術者與助手操作技術與經驗的要求較低。

綜上，應綜合臨床資料、影像學、術者與助手操作技術與經驗、現有導航技術裝備及耗材、衛生經濟學等多種因素選擇其中1種或聯用多種取材方式送檢dIP+mMS。

4 dIP+mMS常用不同取材方式的封裝

TBLB：用無菌注射器針頭將組織粒從鉗杯中挑出，直接置于2 mL 無菌微量離心管內，使其貼附側壁，扣嚴封蓋。TBBr：用無菌剪刀將刷頭剪入（過程中應嚴防浸泡剪刀的乙醇或消毒液沾染刷頭，因該沾染可滅活部分微生物病原形成假陰性）預裝1 mL無菌生理鹽水的2 mL 無菌微量離心管內，扣嚴封蓋。BALF：將不少于5 mL BALF 置于無菌收集器內，扣嚴封蓋。-20 ℃冰箱內短期存放，備用。

5 dIP+mMS 支氣管鏡的選擇、引導內鏡技術及ROSE的輔助使用

對于外周（1/3）肺部感染性病灶的取材，推薦使用細支氣管鏡或超細支氣管鏡，以求盡量深入接近病灶。對于不可直接視及肺部感染性病灶的取材，推薦使用引導內鏡技術，包括手繪導航、虛擬導航、電磁導航、透視等，以求盡量取得代表性病灶本身。作為一種細胞學載體，ROSE 具備相應功能，包括評價取材滿意度，實時指導介入操作手段與方式，形成初步診斷或縮窄鑒別診斷范圍，優化靶部位標本進一步處理方案，結合全部臨床信息與細胞學背景進行病情分析與轉歸預判［7］。這些功能在TBLB 和TBBr 的dIP+mMS 中極其重要，可提高其敏感度、特異度，降低假陰性率。TBLB 和TBBr dIP+mMS 中ROSE 所需耗材，如針頭、玻片等，需預先經清潔、消毒、滅菌。

6 不同取材方式所獲標本遺傳物質的測序方式

對于不同取材方式所獲標本分別提取遺傳物質，合并上機測序（雞尾酒方式），有利于降低成本，但同時也降低了dIP+mMS的敏感性。由于BALF含口腔與主氣道雜菌較多，污染較重，微生物負荷較高，可明顯拉低其他取材方式所獲標本dIP+mMS敏感度，故BALF 應獨立檢測；雞尾酒方式的推薦方案可為：多靶部位TBLB組織粒的混合、多靶部位TBBr刷頭的混合、多靶部位TBLB 組織粒和TBBr 刷頭的混合以及多靶部位BALF的混合。

7 抗菌藥物對dIP+mMS的影響

全身和局部抗菌藥物的應用可顯著影響dIP+mMS 的檢出，形成假陰性；特別需注意抗結核藥物或喹諾酮類抗生素的應用可影響dIP+mMS 對于結核分支桿菌的檢出。

8 dIP+mMS取材部位的選擇

建議于實變而非壞死部位、新發病灶、有變化病灶或病灶與正常組織交界部位取材進行dIP+mMS，不建議于壞死、陳舊病灶、長期無變化病灶或纖維瘢痕、鈣化部位取材進行dIP+mMS。

dIP+mMS在微生物學診斷中發揮著日益重要的作用［8-9］。通過使用細支氣管鏡或超細支氣管鏡，結合引導內鏡技術，應用dIP 在合適部位進行取材，ROSE 實時指導介入操作，從所獲標本提取遺傳物質，上機測序，并緊密結合臨床信息解讀mMS報告，可以為肺部感染患者提供快速精準的病原學診斷依據，及時進行抗感染治療。