基因修飾的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展

張晶瑩，孫曉林，耿立霞△

基因修飾，主要是指利用生物化學(xué)方法修改DNA 序列，達(dá)到改變宿主細(xì)胞基因型或者使得原有基因型得到加強(qiáng)的效果。目前常用于基因修飾的病毒載體有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒3 種。其中腺病毒載體具有制備簡單、易轉(zhuǎn)染、表達(dá)目的基因效果強(qiáng)、免疫排斥反應(yīng)低、安全性好等優(yōu)勢［1］。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一群具有多向分化潛能并可自我復(fù)制的多能干細(xì)胞。目前研究比較多的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow stem cells，BMSCs），但因取材困難、獲取率低等缺點(diǎn)，其臨床應(yīng)用受到限制。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）具有來源充足、取材方便、培養(yǎng)簡單等特點(diǎn)，其臨床應(yīng)用較BMSCs 更有優(yōu)勢。ADSCs呈梭形生長，呈平行排列或漩渦狀，具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，在臨床研究上較BMSCs具有倫理學(xué)和安全性優(yōu)勢［2］。與腫瘤細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和 B 淋巴細(xì)胞等細(xì)胞相同，ADSCs 也具有特異性的細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物，研究證實(shí)ADSCs 陽性表達(dá) CD73、CD105 和 CD90，陰性表達(dá)CD19、CD34 和 CD45［3］。主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）參與免疫呈遞、細(xì)胞間相互識別及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答等，ADSCs 中MHC表達(dá)較低，故其具有低免疫原性［4］，可用于移植治療。ADSCs易被臨床上普遍應(yīng)用的病毒載體系統(tǒng)所轉(zhuǎn)染，經(jīng)骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（Bone morphogenetic protein 4，BMP4）及血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）等基因修飾后移植到體內(nèi)，能特異性合成蛋白質(zhì)，使其對血糖、激素或藥物、化學(xué)因素等生理刺激反應(yīng)更敏感，可有效提高移植后細(xì)胞的存活時間、分化能力和聚集濃度，高效穩(wěn)定地表達(dá)目的基因，為一些傳統(tǒng)治療手段無法治愈的疾病帶來曙光。然而目前對ADSCs的研究仍處于基礎(chǔ)研究階段，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)尚不充分。本文對近年來基因修飾的ADSCs在骨組織修復(fù)、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等疾病的研究進(jìn)展進(jìn)行簡述，并對其臨床研究意義、問題及應(yīng)用前景進(jìn)行探討，為其早日投入臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 基因修飾的ADSCs應(yīng)用于骨組織修復(fù)

骨不連、肢體短縮、大段骨缺損等問題一直是骨科疾病治療的常見難點(diǎn)，如何加快骨再生速度、促進(jìn)術(shù)后骨愈合成為臨床上急需解決的難題。Xu等［5］利用在骨生成過程中起重要作用的成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Osterix，OSX）轉(zhuǎn)染ADSCs，結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組OSX 過表達(dá)且成骨相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，新生骨體積明顯增大，提示OSX修飾的ADSCs對修復(fù)骨組織有積極的治療作用。Chen 等［6］將BMP4 轉(zhuǎn)染至 ADSCs，發(fā)現(xiàn) BMP4 蛋白能夠使 ADSCs定向分化為成骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后ADSCs 的上清液存在大量BMP4、成骨蛋白（膠原蛋白Ⅰ）及軟骨形成蛋白（膠原蛋白Ⅱ），與ADSCs單純培養(yǎng)組相比，轉(zhuǎn)染組成骨形成有關(guān)的蛋白含量明顯上調(diào)，提示BMP4 修飾后的ADSCs 具有加快骨組織修復(fù)的作用。Kim 等［7］通過慢病毒載體將VEGF導(dǎo)入ADSCs中，結(jié)果顯示，與單純培養(yǎng)的ADSCs 相比，轉(zhuǎn)染后ADSCs 中VEGF的表達(dá)量升高10倍，成骨分化表型基因堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALPL）和成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原（Osteoblast type Ⅰ collagen，COL1）表達(dá)明顯上調(diào)，提示VEGF 修飾的ADSCs 可以更好地修復(fù)骨組織損傷。

2 基因修飾的ADSCs應(yīng)用于糖尿病的治療

Ⅰ型糖尿病是由于胰島β 細(xì)胞被破壞無法再生，導(dǎo)致胰島素絕對缺乏引起糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的一類綜合征。胰島移植是目前治療Ⅰ型糖尿病很好的替代治療手段，具有不良反應(yīng)少、相對安全的優(yōu)勢。ADSCs可以誘導(dǎo)胰腺胰島素分泌細(xì)胞的再生，并且能夠抑制自身免疫反應(yīng)，從而提高同種異體胰島移植的存活率，是胰島素分泌細(xì)胞來源的理想選擇。胰-十二指腸同源盒1（Pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX-1）是在胰腺發(fā)育中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)胰島素在胰島β細(xì)胞中的表達(dá)，并可特異性激活基因的轉(zhuǎn)錄。Bahrebar 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，將 PDX-1 修飾人 ADSCs 后可以導(dǎo)致胰島樣細(xì)胞聚集，并且一些與胰島相關(guān)的基因和胰島素呈現(xiàn)高表達(dá)。此外，Gao等［9］將PDX-1轉(zhuǎn)染至ADSCs 15 d后仍可檢測到PDX-1的表達(dá)，且胰島素表達(dá)水平明顯高于對照組，可有效降低糖尿病大鼠的血糖水平。Liu 等［10］利用肝細(xì)胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）修飾ADSCs 用于治療勃起功能障礙的糖尿病大鼠，結(jié)果顯示，修飾后的ADSCs可使糖尿病大鼠陰莖海綿體內(nèi)皮和平滑肌含量增加，使勃起功能明顯改善。Zhang 等［11］將神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子1（Neuroaxon guidance factor 1，Netrin-1）導(dǎo)入ADSCs，研究其對糖尿病小鼠慢性缺血后肢的治療效果，發(fā)現(xiàn)其可有效調(diào)節(jié)ADSCs 的增殖、遷移、黏附和抗凋亡能力，促進(jìn)缺血組織的血管生成，使后肢肌肉的微血管密度升高，加強(qiáng)血運(yùn)重建，為治療糖尿病周圍神經(jīng)血管疾病提供新的思路。

3 基因修飾的ADSCs應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療

神經(jīng)系統(tǒng)疾病是一種起病緩慢、病程呈進(jìn)行性發(fā)展、預(yù)后極差的疾病。目前的治療手段主要以生物學(xué)藥物為主，但治療效果并不理想。ADSCs 作為組織工程學(xué)理想的種子細(xì)胞，為修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)病變的治療帶來新的希望。He 等［12］利用具有調(diào)節(jié)周圍神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)功能的miR-34a 修飾ADSCs，移植治療坐骨神經(jīng)損傷大鼠，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)遠(yuǎn)高于對照組，能密切反應(yīng)肌肉神經(jīng)支配程度的腓腸肌質(zhì)量顯著增高，髓鞘發(fā)達(dá)的軸突數(shù)目和直徑與正常神經(jīng)組織相似，為神經(jīng)再生提供了新的思路。Ghazavi 等［13］將具有神經(jīng)保護(hù)作用的成纖維細(xì)胞生長因子1（Fibroblast growth factor 1，F(xiàn)GF1）導(dǎo)入ADSCs后觀察其對短暫實(shí)驗(yàn)性缺血性腦卒中大鼠的影響，發(fā)現(xiàn)大鼠梗死區(qū)域細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低、腦梗死體積減少，提示FGF1 修飾ADSCs 可用于治療缺血性腦卒中。此外，F(xiàn)orouzanfar 等［14］利用FGF1轉(zhuǎn)染ADSCs 后靜脈注射治療慢性壓迫性損傷大鼠，結(jié)果顯示，其可有效減弱慢性壓迫性損傷大鼠機(jī)械性及熱超敏反應(yīng)，減少脊髓結(jié)構(gòu)改變，為治療臨床神經(jīng)性疼痛奠定基礎(chǔ)。

4 基因修飾的ADSCs應(yīng)用于心血管疾病的治療

急性心肌梗死是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，是全世界死亡率和發(fā)病率最高的疾病之一，傳統(tǒng)的藥理學(xué)治療并不理想，僅能延緩病情發(fā)展。Tbx20作為T-box轉(zhuǎn)錄因子之一，具有調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生長的作用。Neshati等［15］利用Tbx20轉(zhuǎn)染ADSCs，可以有效增強(qiáng)心肌分化標(biāo)志物如輔肌動蛋白α1（Recombinant actinin alpha 1，ACTN 1）、心肌肌鈣蛋白I（Cardiac troponin I，cTnI）、心肌肌動蛋白α1（Cardiac actin α1，ACTC 1）、心臟特異性同源盒（cardiac specific homeobox，Csx）基因（又稱Nkx2.5）等的表達(dá)，為再生醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生心肌樣細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。Zhang 等［16］利用胰島素基因增強(qiáng)子結(jié)合蛋白1（Insulin gene enhancer binding protein 1，ISL-1）轉(zhuǎn)染ADSCs，并與新生大鼠的心室心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，模擬體內(nèi)微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)ISL-1 過表達(dá)可顯著增加自發(fā)搏動ADSCs 比例，與竇房結(jié)表達(dá)有關(guān)的基因環(huán)化核苷酸調(diào)控的陽離子通道亞型4（Hyperpolarizationactivated cyclic nucleotide-gated cation channel 4，HCN4）及起搏細(xì)胞關(guān)鍵標(biāo)志物縫隙連接蛋白45（Connexin45，Cx45）明顯增加，為生物起搏器生成提供依據(jù)。Chen 等［17］構(gòu)建表達(dá) miR-1 的慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染ADSCs，與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，過表達(dá)的miR-1 可以促進(jìn)ADSCs 向心肌細(xì)胞分化，心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）及 轉(zhuǎn) 錄 因 子 GATA 結(jié) 合 蛋 白 4（GATA-binding protein4，GATA4）表達(dá)明顯升高，為再生醫(yī)學(xué)治療心肌梗死提供新的思路。

5 基因修飾的ADSCs應(yīng)用于其他疾病

Feng等［18］利用miR-21修飾ADSCs，研究發(fā)現(xiàn)修飾后ADSCs 可以改善尿道傷口愈合微環(huán)境，增強(qiáng)干細(xì)胞存活能力，有效調(diào)節(jié)血管生成基因表達(dá)，促進(jìn)新生血管生成，可有效治療尿道損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞可以移植治療繼發(fā)性淋巴水腫［19］。Deng 等［20］利用同源異型盒基因轉(zhuǎn)錄因子1（Prospero-related homeobox 1，Prox1）轉(zhuǎn)染人ADSCs，結(jié)果顯示，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物表達(dá)增加，成功誘導(dǎo)人ADSCs 分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，解決了淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞低產(chǎn)的問題。Liu 等［21］研究OX40-Ig 融合蛋白（OX40-immunoglobulin，OX40-Ig）修飾的ADSCs 對大鼠腎移植的作用，結(jié)果顯示，修飾的ADSCs 能明顯延長移植腎的平均存活時間，減少同種異體移植排斥反應(yīng)。

6 結(jié)論與展望

綜上所述，基因修飾的ADSCs 可以使目的基因高效表達(dá)，延長干細(xì)胞的存活時間，分泌對疾病有療效的特定蛋白，在臨床應(yīng)用上有巨大潛能。盡管基因修飾的ADSCs 在動物實(shí)驗(yàn)研究中表現(xiàn)出顯著療效，但目前尚未經(jīng)過臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。如何在臨床上利用基因修飾的ADSCs 治療疾病，還有許多問題需要深入研究。各種疾病如何選擇對應(yīng)適宜的基因進(jìn)行修飾、應(yīng)用修飾的ADSCs治療疾病的最佳時機(jī)、療效最佳的移植劑量、載體系統(tǒng)的安全性等問題均有待研究。總之，基因修飾的ADSCs 為各種疾病的治療提供了新的思路，但相關(guān)研究還處于初級階段，很多問題有待深入挖掘。