乙醇作用時間對大鼠子宮內膜損傷的影響

南楠，梁敏，劉婷婷，陳西華，王樹芳，汪坤，祝立權，張博男，賀斌，徐祥波*

(1.國家衛生計生委科學技術研究所，北京 100081；2.北京協和醫學院研究生院，北京 100730；3.新鄉醫學院，新鄉 453003)

子宮內膜的修復障礙大部分由炎癥和手術所致[1]，而主要原因是流產時刮宮術引起的子宮損傷導致的宮腔粘連。據文獻報道，造成宮腔粘連的手術類型以妊娠期手術操作最多，占比93.01%，其中早孕期清宮占比54.59%[2]。宮腔粘連是指子宮的創傷導致子宮內膜基底層受損，使宮腔部分或全部閉塞從而導致月經異常、不孕或反復流產等。不孕不育是生殖領域亟需解決的一大問題，而胚胎和子宮是成功妊娠的兩個重要因素。宮腔粘連是導致妊娠失敗子宮方面的主要因素[3-4]，給許多女性生活帶來極大的困擾。目前，宮腔粘連形成的確切機制尚不清楚。

子宮內膜損傷實驗動物模型的建立是研究薄型子宮內膜/宮腔粘連的重要平臺。本研究中，根據以往對子宮損傷模型相關文獻的閱讀[5]，參考已經使用得比較成熟的對大鼠子宮造成化學損傷的試劑，我們采用95%乙醇損傷大鼠子宮內膜，觀察95%乙醇不同作用時間下子宮內膜的損傷修復情況，旨在探討不同乙醇作用時間對子宮內膜損傷修復的影響，以及建立優化的大鼠子宮內膜損傷模型。

材料與方法

一、實驗動物及試劑

1.實驗動物：8～10周齡性成熟且未交配的雌性SD 大鼠，SPF級，由北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]提供。于國家衛生計生委科學技術研究所[SYXK(京)2009-0033]飼養，室溫23～25℃，濕度67%～75%，光照明暗時間比為14 h/10 h，能自由獲取充足的食物和水。按照性周期一致性原則，每籠飼養3只大鼠。

2.主要實驗試劑：95%乙醇(北京化工廠)，蘇木精-伊紅染液(北京中杉金橋)，天狼星紅染液(上海翊圣生物)

3.主要儀器：生物組織包埋機(浙江科迪儀器設備)，蠟塊切片機(Leica，德國)，光學顯微鏡(Leica，德國)，偏振光顯微鏡(上海蒲拓光電儀器)

二、研究方法

1.SD大鼠子宮內膜損傷實驗：將25只SD大鼠隨機分為5組，每組5只，一組僅開腹縫合作為對照組，另外4組為實驗組，分別以95%乙醇作用15 s、30 s、60 s、120 s。用10%水合氯醛溶液進行麻醉，注射劑量為3 ml/kg，麻醉后放入無菌手術臺，仰臥，消毒后腹部陰道口向上1 cm左右進行開口，輕輕夾出V型子宮，用動脈夾夾住子宮近陰道端，用注射器分別向子宮推入300～500 μl 95%乙醇，使子宮保持充盈狀態。作用結束后將95%乙醇吸出，并用生理鹽水洗滌子宮腔3遍，將子宮塞回，縫合傷口并消毒放回。每組5只大鼠。術后7 d 脫頸處死SD大鼠，獲取大鼠子宮，進行拍照并固定于4%多聚甲醛。

2.組織形態學觀察：大鼠子宮組織于4%多聚甲醛固定后，取子宮中間部分進行常規石蠟包埋，5 μm厚度進行切片，脫蠟，水化，進行HE染色觀察子宮組織形態學，天狼星紅染色觀察其偏光鏡下纖維化程度。

3.腺體數及子宮內膜厚度統計和分析：每組大鼠子宮隨機選取5張切片進行HE染色，計數每張片子宮內膜腺體數目，取其平均值。子宮內膜厚度則是每組隨機選取5張切片，4個方向用顯微鏡測微尺測量厚度，求取每一張片子厚度平均值后，并求取5張片的子宮內膜厚度平均值。

三、統計學方法

采用Excel進行統計學分析。實驗數據以(平均數±標準差)表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩樣本之間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、95%乙醇不同作用時長下大鼠狀況

實驗組和對照組的大鼠在術后1周內狀態良好，眼神有光，毛色順亮，精神狀態良好，無死亡，飲食正常，排泄正常。

二、子宮形態學變化

1.大鼠子宮形態：術后7 d，對照組子宮較細，整體粗細均勻一致，外觀平整光滑，富有彈性(圖1A)；95%乙醇作用15 s組子宮與對照組無太大差異(圖1B)；作用30 s組子宮出現淤血，有水腫現象存在，管壁呈紅色子宮外觀較光滑(圖1C)；作用60 s組子宮管壁表面出現皺痕，有明顯淤血，子宮內膜有出血殘留的血凝塊(圖1D)；而作用120 s組子宮壁粗糙，形態不規則，且韌性極差，整個子宮均出現出血造成的血凝塊，損傷嚴重(圖1E)。

2.組織HE染色：相對于對照組(圖2A/a)，95%乙醇作用15 s組出現子宮內膜纖維化，有輕度的宮腔黏連現象，部分子宮腔上皮脫落，癥狀較輕，腺體分布不規律，較紊亂(圖2B/b)；乙醇作用30 s組子宮內膜腔上皮細胞已經全部損傷，幾乎無腺體存在，出現更嚴重一些的宮腔粘連，子宮內膜纖維化程度加重(圖2C/c)；乙醇作用60 s組子宮內膜已經開始出現凝固性壞死，子宮內膜大面積損傷脫落，子宮宮腔變大，子宮內膜基底層也受到了一定的影響(圖2D/d)；乙醇作用120 s組子宮內膜腔上皮至基底層全部損傷，形成空腔，出現更大的面積的凝固性壞死，已形成不可修復的子宮內膜的損傷(圖2E/e)。

A：對照組；B～E：95%乙醇分別作用15 s、30 s、60 s、120 s圖1 95%乙醇不同作用時長下大鼠子宮形態的比較

A、a：對照組；B～E、b～e：95%乙醇分別作用15 s、30 s、60 s、120 s(A～E為5倍視野下觀察結果，a～e為上圖標注*處20倍視野下放大結果)圖2 95%乙醇作用不同時長下的子宮內膜形態(HE染色)

3.子宮內膜腺體數量和子宮內膜厚度：子宮內膜腺體數量方面，與正常對照組相比，從95%乙醇作用15 s開始其腺體數目顯著減少(P<0.05)，至作用120 s時，鏡下已經基本檢測不到腺體的存在(圖3A)，而各處理組之間腺體的數量無顯著差異(P>0.05)；在子宮內膜厚度方面，乙醇作用15 s和30 s的處理組中大鼠子宮內膜的厚度與對照組無顯著差異(P>0.05)，隨后在95%乙醇作用60 s處理組中子宮內膜開始變薄，至120 s大鼠子宮內膜厚度均比正常對照組薄(圖3B)，并且與正常對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。

NC：對照組；與對照組比較，*P<0.05圖3 95%乙醇作用不同時長后腺體數目和子宮內膜厚度的比較

4.組織天狼星紅染色：我們對大鼠子宮組織進行切片，用天狼星紅染色。天狼星紅染液為強酸性染料，與膠原分子中的堿性基團結合被染成紅色，在偏振光鏡下對纖維化病變分型和分級有幫助作用。從天狼星紅染色可以看出，95%乙醇的作用的確已經對子宮內膜產生了損傷，并使子宮發生了纖維化(圖4A～E)。但是就天狼星紅結果而言，并未發現明顯的組間差異。

A：對照組；B～E：95%乙醇分別作用15 s、30 s、60 s、120 s圖4 95%乙醇作用不同時長下的子宮內膜形態(天狼星紅染色×4)

討 論

我們采用化學損傷法設計、建立和優化大鼠子宮內膜損傷模型。目前，子宮內膜損傷模型建立的方法主要有熱損傷法[6]、吸宮法、電凝法[7]、機械損傷法[8]、化學損傷法[5]和聯合使用法[9]。其中熱損傷法利用的是“熱球”內膜去除原理，手術置入宮腔導管，利用溫度造成子宮內膜損傷；吸宮法是利用負壓對子宮內膜進行吸宮，造成損傷；電凝法是利用電擊的方法對子宮內膜進行損傷；機械損傷是利用刮匙對子宮內側進行刮傷；化學損傷法則是利用酒精對子宮內膜進行損傷。本研究經過比較決定采用化學損傷的方法，建立子宮內膜宮腔粘連模型。已有文獻報道用95%酒精建立了大鼠薄型子宮模型[10]和宮腔粘連酒精損傷模型[11]，作用時間分別為5 min和3 min。為了驗證95%乙醇損傷子宮造模的最佳作用時長，我們開始觀察和驗證不同作用時間下的子宮內膜狀態。

目前而言，做子宮內膜損傷模型常用的動物是兔子[12]、大鼠[13]和小鼠[14]。根據生長周期，手術操作難易等各方面綜合考慮，我們決定采用大鼠。大鼠生長周期較短，麻醉開口較簡單，且子宮大小合適，手術方便，其動情周期較規律易觀察。

本研究可看出，95%乙醇作用15 s的一組，其子宮子宮腔有部分損傷，且腺體減少，有纖維化現象；作用30 s后的子宮，腔上皮細胞全部脫落，且纖維化程度更加嚴重，基底層細胞排列凌亂，數量減少，存在一定的自我修復現象，且形成了宮腔粘連；而95%乙醇作用60 s和120 s的子宮形成較大的子宮腔，基層已經受到一定或徹底的損傷，自我修復能力幾乎為零。根據與臨床觀察結果相比較，95%乙醇作用15～30 s的損傷程度能有效地模仿臨床刮宮效果，建立大鼠宮腔粘連模型。

另外，通過子宮內膜腺體數量統計分析發現，不同乙醇作用時長的實驗組子宮內膜的腺體數量明顯減少，說明95%乙醇能夠影響子宮內膜腺體的數量。大鼠子宮內膜厚度統計結果顯示，95%乙醇作用時長在15 s和30 s時子宮內膜厚度與對照組相比并無太大變化，作用時長在60 s時子宮內膜厚度明顯比正常對照組薄，而作用時長為120 s時子宮內膜厚度僅為正常對照組的1/3左右。以往文獻報道，正常女性子宮壁厚度在10～10.6 mm左右[15]，對243例刮宮術術后患者子宮內膜厚度分析，刮宮一次的患者子宮壁厚度均值在9.66～9.85 mm左右，刮宮兩次的患者其子宮壁厚度約在8.9～8.92 mm左右，刮宮三次及四次者其均值約在7.32～7.70 mm之間。因此，在本研究中，推薦在本動物模型中95%乙醇處理時間在15～30 s之間最為合適，對子宮內膜的損傷程度可能貼近臨床上的刮宮損傷程度，以滿足臨床不同程度內膜損傷機理的研究。