乳品中有害微生物檢測技術的研究進展

陳嘉惠，陳沁，鈕冰

（上海大學生命科學學院，上海201900）

0 引 言

乳品在人們的膳食結構中具有十分重要的地位，乳品富含人體所需的蛋白質、脂肪、糖類和維生素等營養物質[1]。乳品營養豐富，同時也是微生物的良好培養基，微生物污染引起的乳品安全事件頻繁發生，2002年美國FDA在乳品巨頭企業所生產的嬰幼兒配方奶粉中，檢測出阪崎腸桿菌；2008年法國寶怡樂公司生產的一批嬰幼兒奶粉被召回，這一批次產品可能受到沙門氏菌污染；2011年我國國家質檢總局在蒙牛公司生產的一批純牛奶中檢測出黃曲霉毒素M 1含量超標。乳品安全意義重大，它對消費者的健康產生嚴重影響，還與中國乳品、食品行業，甚至國際形象息息相關[2]。因此，完善乳品中有害微生物的檢測技術，對于提高乳品的質量安全和確保消費者的健康問題具有重要的意義。

1 乳品中常見有害微生物

1.1 腐敗型微生物

乳品中常見腐敗型微生物可分為細菌和真菌兩大類，細菌又可分為耐熱菌與嗜冷菌。乳品中污染能力較大的耐熱菌為部分異型乳酸菌，這些異型乳酸菌具有一定的抗熱性，60℃下可存活20分鐘，當其出現在密閉條件下的原料乳中時，會大量增殖導致原料乳的酸敗，這種污染后的原料乳不能用來生產超高溫瞬時滅菌乳（Ultra High Temperature treated，UHT），而發酵乳被這些異性乳酸菌污染時，會產生一些不良的風味物質，導致乳品變質而不能食用；乳品中常見的耐熱菌還有芽孢桿菌屬，如枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌等，芽孢桿菌屬能分解生乳中的蛋白質和脂肪，不僅會產生腐敗味，還會導致鮮奶產氣。嗜冷菌同樣是乳品中的腐敗菌，國際乳品聯合會（International Dairy Federation，IDF）提出，凡是在7℃以下能生長的細菌為低溫菌，而在20℃以下能繁殖的細菌為嗜冷菌。乳品中的嗜冷菌有：假單胞菌屬、醋酸桿菌屬、明串珠菌屬、氣單胞菌屬等[3]，以假單胞菌屬中的腐敗假單胞菌為例，腐敗假單胞菌可從水和土壤中分離得到，是一種兼性厭氧菌，其代謝產生的脂肪酶和蛋白酶是最耐熱的，會導致超高溫瞬時滅菌乳（UHT）在貯存期內產生結皮、變味、脂肪上浮等現象。乳品中另一大類腐敗型微生物為部分真菌，食品被其污染后會腐敗變質，產生大量的真菌毒素，誤食可導致中毒。黃曲霉是這類真菌的典型代表之一，其代謝產物是黃曲霉毒素，是真菌毒素中較常見的毒素，可導致DNA損傷，并具有遺傳性，其中黃曲霉素M 1常存在于乳制品中，毒性較強[4]。1993年世界衛生組織（WHO）和國際癌癥研究所將黃曲霉素確定為一級人類致癌物。

1.2 致病型微生物

致病型微生物的主要類型有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和阪崎腸桿菌等[5]。金黃色葡萄球菌是一種廣泛存在于自然界的致病菌，革蘭氏陽性菌的代表，其污染食物的主要原因是能產生對熱穩定的腸毒素，可引起惡心、腹瀉嚴重時可導致呼吸困難和休克等癥狀；大腸桿菌是人和部分動物腸道內最主要的一種菌，部分菌株具有致病性，是重要的食源性致病菌，其中毒力較強的是腸出血性大腸桿菌，食用其污染的乳品后，會導致嚴重的腹痛與腹瀉，重者可能引起便血與高熱，同時大腸桿菌是乳品國家標準規定中主要的檢測菌群；沙門氏菌是重要的食源性致病菌之一，分布較為廣泛，大多數菌能產生內毒素，所以對人體和其他動物有致病性，受其感染的人和動物會出現傷寒、副傷寒等病癥，一旦進入血液組織，則會導致系統性炎癥，甚至死亡[6]；阪崎腸桿菌屬于腸桿菌科，主要寄生在人和動物的腸道內，嬰幼兒食入阪崎腸桿菌污染的乳粉，可能導致腦膜炎、敗血癥及新生兒壞死性小腸結腸炎等癥狀[7]。我國2010新修訂的《食品安全國家標準嬰幼兒配方食品》GB 10765-2010，已將阪崎腸桿菌列入微生物限量控制指標[8]。致病型微生物主要通過奶牛進入乳制品中，加工過程中消毒或殺菌不徹底會導致污染的擴散，從而引起乳及乳制品變質，食用后會引起中毒等一系列癥狀。

2 乳品中微生物的檢測技術

2.1 計數法

我國比較傳統的微生物檢測方法主要包括標準平板計數法（SPC）和顯微鏡直接觀察法（DMC）兩種方法。它的原理是對活菌的總數進行測定，我國現行國標GB/T 4789.2—2016規定采用以上兩種方法對菌落總數進行測定[9]。這兩種方法的優點是設備簡單、成本低廉，因此受到了社會各大企業和質量監督檢測部門的普遍歡迎。缺點是操作煩瑣、檢測周期長，且靈敏度相對較低，無法檢測乳品中全部的微生物，因此檢測效果較差[10]。在傳統計數法基礎上，Margot[11]等人開發了一種新型顯色培養方法，用以快速檢測沙門氏菌，結果顯示該方法對沙門氏菌的特異性可以達到100%，可用于乳品中沙門氏菌的檢測，與標準方法比縮短了檢測時間。除此之外，Teramura[12]等人對市售的四種顯色培養基進行比較，以建立檢測乳粉中阪崎腸桿菌的標準方法。顯色培養方法與傳統計數法相比，提高了靈敏度和檢測效率，常用于乳品中沙門氏菌、阪崎腸桿菌和李斯特氏菌的檢測。

2.2 免疫學檢測技術

2.2.1 ELISA法

酶聯免疫吸附測定法(Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay,ELISA)是一種將抗原、抗體免疫反應的特異性與酶催化作用的高效性有機結合起來的方法。Portanti[13]等人根據單克隆抗體原理建立的一種新型捕獲ELISA法用于識別食品中單核細胞增生李斯特氏菌，其中包括乳制品的檢測，實驗結果表明該法對李斯特氏菌屬具有100%的特異性，與國際組織的標準化相比，具有顯著的一致性。Yazdankhah[14]等人將ELISA方法與免疫磁性分離技術聯用檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌，最低檢測限為1×105CFU/mL，檢測時間為3小時，這種聯用技術極大的提高了檢測效率。ELISA方法目前已被開發成商品化試劑盒，用于乳品安全檢測，其優點是靈敏度很高，所得結果與標準平板計數法相似、操作簡便快捷以及受樣品干擾小，適用于食品中微生物和生物毒素的快速檢測。但也存在著一些缺陷，比如檢測過程中樣品中若存在結構類似的化合物則可能發生交叉反應，檢測分子量較小或很不穩定的化合物時有一定的困難，隨著酶聯免疫技術的不斷完善和發展，該技術將會得到進一步的發展。

2.2.2 免疫熒光技術

免疫熒光技術（Immunofluorescence）也稱熒光抗體技術，是將免疫學方法與熒光標記技術結合起來鑒定和檢測細胞或組織切片中相應抗原（抗體）的方法。該技術是由Nerurkar等[15]在1984年建立的，可用來檢測沙門氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、E·Coli O 157。Song[16]等人提供了一種使用無標記免疫熒光條傳感器檢測大腸桿菌O 157∶H 7的快速簡單方法，將熒光素異硫氰酸酯（FITC）加入到樣品培養基中以制備用于無標記條帶傳感器的熒光探針，并保持與針對大腸桿菌O 157∶H 7的單克隆抗體的良好親和力，當樣品中存在大腸桿菌O 157∶H 7時，富集激發后會發出黃綠色熒光，當樣品溶液遷移到條帶的末端時，熒光細菌與捕獲抗體結合，從而在測試區域上形成可見的黃綠色線，這種方法檢測迅速，可用于現場快速檢測。免疫熒光技術的主要特點為特異性強、快速簡便、靈敏度高及測試費用低。然而，這種方法在交叉反應、假陽性、非特異性染色等問題上仍需要進行改進。

2.2.3 免疫膠體金技術

免疫膠體金技術(Immune colloidal gold technique)是一種新型免疫標記技術，其原理是以膠體金作為示蹤標記物，結合抗原抗體反應，進行定性或半定量的快速檢測。1971年Faulk和Taytord[17]首次將膠體金引入免疫學，用來研究沙門氏菌菌壁細胞抗原成分。隨著該技術的發展，Rong[18]等建立了一種基于多克隆抗體的膠體金試紙條檢測方法，用于檢測金黃色葡萄球菌腸毒素B，該方法在緩沖液中檢測限為1 ng/mL，在牛奶中檢測限為10 ng/mL，靈敏度較高。目前，沙門氏菌抗原、李斯特菌抗原等可用專門的商品化檢測卡進行檢測，此種方法靈敏準確、快捷迅速、安全簡便且不需任何設備和儀器，只需制備好試劑盒或測試條即可。與ELISA方法相比，膠體金本身具有顏色，省略了添加顯示液和終止液的步驟，簡化了操作，更適合于野外或現場應用。

2.3 ATP生物熒光技術

ATP生物熒光檢測技術原理是將微生物內自由的可溶解的ATP釋放出來，在有熒光素酶等存在條件下與蟲熒光素發生反應產生熒光，通過熒光信號的強弱計算出ATP的含量，推算出樣品中的含菌量。1970年，Sharpe等[19]首次利用ATP生物熒光技術檢測了牛奶中細菌含量，隨后這個方法很快應用到不同種類的乳品中微生物含量的檢測，如Samkutty等[20]利用ATP生物熒光技術預測了原料乳中的總菌數，所得結果與平板計數法所得結果的相關性約為80%。Cunha等[21]人應用ATP生物熒光技術評價超高溫滅菌乳中微生物的含量，實驗采用三種不同成分的培養基對乳品中微生物進行培養，不同培養基的平板計數結果與ATP生物熒光技術結果皆有顯著相關性。兩者實驗結果也證明了ATP生物熒光技術可用于不同加工方式乳品中微生物含量的檢測。與傳統的檢測技術相比，ATP熒光檢測技術的優勢是無需進行微生物培養，檢測速度快，操作簡便，低端手持型ATP生物熒光檢測儀僅需一人即可完成所有檢測；缺點是低端檢測儀靈敏度較低，效果不太理想；高端檢測儀相關試劑較貴；檢測過程中受游離ATP、體細胞以及鹽等成分干擾。

2.4 流式細胞檢測法

流式細胞術的原理是對懸液中的單細胞或其他生物粒子，通過檢測標記的熒光信號，實現細胞的定量分析和分選。流式細胞儀由液流系統、光學系統、電子系統、分析系統等構成設備的主要部分。Cassoli等[22]使用流式細胞檢測法和標準平板計數兩種方法對來自于100個農場并存儲24，48或72小時后的散裝牛奶進行分析，結果顯示這兩種方法的相關性極高并由此建立了一種轉換關系，最后評估了它們之間的轉換關系，不受樣品存儲時間的影響。Ikeda[23]等人將微流控芯片技術和熒光原位雜交技術應用到流式細胞檢測法上，用于快速鑒定牛奶中的單核細胞增生李斯特氏菌。與標準平板計數法相比，流式細胞檢測法有許多優勢，該技術無需進行樣品的前期制備和培養，節省了大量的時間、人力和物力等，在現代化快速生產要求越來越高的今天，該技術十分實用。該技術的弊端是前期投入相對較高，樣品處理以及熒光染料的選擇會影響檢測結果，且流式細胞儀價格較高，日常維護費用也相對昂貴，并且對操作人員專業素養要求相對較高。

2.5 PCR技術

2.5.1普通PCR技術

1983年Millus等[24]發明了PCR(Polymerase chain reaction)技術，該技術可以通過特異性地擴增某種微生物的基因片斷而實現快速檢測。馬冬等[25]用大腸桿菌人工污染乳樣品，對污染前后全脂乳和脫脂乳中的大腸桿菌應用PCR擴增技術進行檢測，檢出限分別為104CFU/mL，1 CFU/mL，實驗證實PCR法用于乳品中大腸桿菌檢測的可行性。但是要達到實際應用，還應對可能存在于乳品中的其他微生物對PCR反應特異性的影響進行更深入的研究。Amagliani[26]等人采用基于DNA磁性捕獲的PCR法，檢測了巴氏滅菌全脂乳中的單核細胞增生李斯特氏菌，檢測限達到10 CFU/mL，該方法顯示出較高的特異性和靈敏度。與傳統檢測方法相比，PCR技術最大的特點是快速、準確，簡便。通常在幾小時內便可完成對微生物的測定。但缺點是其在檢測中不能區分活細胞和死細胞，并且僅限于核酸序列已知的微生物的鑒定，同時其定量能力較差。

2.5.2 多重PCR技術

多重PCR(multiplex PCR)的原理是在同一PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，可以對大腸桿菌、沙門氏菌和致病性弧菌等幾種微生物進行同步檢測。Nandi等人[27]使用兩重PCR檢測牛奶中腹瀉性大腸桿菌的2個重要毒素基因，產生志賀毒素的大腸桿菌（STEC）和產腸毒素大腸桿菌（ETEC）的stx2和elt基因，多重PCR可快速和有效地檢測牛奶中的STEC和ETEC，證明了多重PCR在乳品微生物檢測上的便利性。劉繼超等人[28]應用三重PCR對原料乳中沙門氏菌、無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌進行了研究，使用該方法檢測的30份乳品樣品中，沙門氏菌檢出率為46.7%，無乳鏈球菌檢測率為53.5%，金黃色葡萄球菌檢測率為50.0%，與國標方法的檢測結果完全一致，檢測結果驗證了多重PCR方法具有良好的可行性和實用性。多重PCR方法將傳統方法中大量的生化試驗轉化為一次性擴增，便于批量檢測，結合國家標準或行業標準，使用多重PCR方法對乳品樣品進行致病微生物初篩，可大大縮短檢測周期，降低檢驗成本，在乳品污染型微生物、致病型微生物及環境微生物檢測中具有重要作用，具有較好的應用前景。但該方法容易出現假陰性的結果，故應用時需要改進樣品處理技術、去除食品抑制因子干擾，同時與其他技術整合應用。

2.5.3 實時熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR(Real-time fluomgenetic quantitative PCR)也可應用到乳品微生物的檢測中。Graber[29]等采用實時熒光定量PCR成功檢測了患乳房炎奶牛的牛乳中致病菌金黃色葡萄球菌的數量。Paul[30]等人將該技術用于檢測生乳中大腸桿菌O157，并且在總測定時間3小時內獲得1 CFU/mL的檢測極限。熒光定量PCR技術的發明比定性PCR技術晚出現10年，相對于定性PCR來說，其具備熒光定量重復性好、穩定性能高、特異性強的特點。缺點是容易出現假陽性結果且儀器和試劑成本相對較高，當然，實時熒光定量PCR技術的發展，不能與其他傳統和分子學方法相脫離，而應與它們結合起來以實現優勢互補。有些學者將多重PCR和實時定量PCR結合進行相關檢測，Hyeon[31]等開發了一種快速靈敏的多重實時PCR檢測方法，用于同時檢測嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌和沙門氏菌，將建立的多重實時PCR系統應用于人為污染的嬰幼兒配方奶粉時，沙門氏菌和阪崎腸桿菌的檢測限為103CFU/mL，富集24小時后，可以在約0.1 CFU/mL的初始接種水平檢測沙門氏菌和阪崎腸桿菌。

2.6 電化學生物傳感器檢測法

電化學生物傳感器是一種由分子識別元件和轉換元件組成，以電勢、電流等為特征檢測信號的傳感器。其中，分子識別元件可以是生物體成分或者生物體，而轉換元件為電極。Zelada[32]等人將電位測定與核酸適配體結合在生物傳感器中以檢測半脫脂牛奶中的大腸桿菌，核酸適配體共價結合單壁碳納米管修飾的電極，與牛奶樣品中的大腸桿菌O 157∶H 7相互作用產生電壓的變化，從而間接地檢測出牛奶中細菌的含量，快速檢測線性響應達到104CFU/mL，響應時間為2分鐘。Avila[33]等制備了基于功能化磁珠和金絲網印刷電極的一次性安培型磁電免疫傳感器，用于特異性檢測和定量葡萄球菌蛋白A以及金黃色葡萄球菌，所建立的方法顯示出非常低的檢測限1 CFU/mL，分析時間為2小時，并且對來自牛奶的最常見的食源性病原體具有良好的選擇性。電化學生物傳感器是生物傳感器中使用最為廣泛的一類傳感器，它優點是換能器便宜，受檢測樣品的濁度影響較小，傳感器檢測過程輸出的電信號可直接在電路中轉換，降低了儀器的復雜性，有利于儀器的微型化和集成化，常用于現場快速檢測。當然電化學生物傳感器尚存在一些缺陷，目前傳感器制作的不夠均一，使設置空白和標準品對照檢測的作用降低，并且其識別元件的壽命、穩定性和非特異性結合方面依舊存在一定的局限性，不能完全實現對乳品等復雜體系的實時、在線、超靈敏自動化檢測。

2.7 基因芯片技術

基因芯片（Gene chip）技術通常采用原位合成或顯微打印手段，將數以萬計的DNA探針固化于支持物表面，得到DNA探針陣列，然后與標記的樣品分子進行雜交，通過雜交信號強度來實現對生物樣品的檢測。Jin[34]等人構建了基于多重微珠的生物芯片系統，針對乳品中較為常見的八種不同致病菌進行同時檢測，將來自乳品微生物的基因片段泵入芯片系統并與特定的寡核苷酸修飾的微珠雜交，由雜交反應產生的熒光信號在30分鐘內即可獲得，檢測范圍為500-6×103CFU/mL。Chiang[35]等開發設計了一種新型塑料基因芯片，用于同時檢測乳品中較常出現的八種葡萄球菌，結果表明該方法不僅快速、靈敏，而且特異性較高。應用基因芯片技術可以達到高通量、微型化、自動化檢測，相比于傳統單一的檢測方法，生物芯片的優勢更加顯著，靈敏度高、特異性強、操作簡便，可同時檢測多種微生物。我國國家生物芯片中心等單位已開發并生產了用于食源性致病菌檢測、食源性病毒檢測的生物芯片技術平臺，包括儀器和試劑盒[36]。然而基因芯片檢測技術仍面臨著一些問題，樣品制備過程復雜，芯片制作昂貴，檢測結果不具有標準化等。相信隨著芯片制作及雜交條件的不斷升級換代，基因芯片技術必將得到更廣闊的發展空間。

3 展 望

乳品安全問題一直以來都是人們關注的焦點，乳品受微生物污染的問題日益凸顯，成為威脅乳品質量安全的重要原因，乳品微生物檢測技術能有效的避免和預防食源性疾病的發生。乳品中微生物的檢測方法是多種多樣的，且各種方法都有其自身的特點。總體來說，如傳統檢測方法檢測設備簡單，成本較低，但實驗操作復雜，不利于現場檢測；PCR檢測技術特異性強，靈敏度高，卻易受到樣品影響，出現假陽性、假陰性的結果；流式細胞檢測技術操作簡單、快速，但儀器昂貴，成本較高；基因芯片技術的興起，從根本上改變了微生物的檢測方法，實現了高通量檢測，卻也存在著樣品制作復雜、芯片昂貴等問題。隨著分子生物學的發展，一些新的微生物檢驗方法和技術不斷涌現，各項檢測技術來到一個新紀元，它們的結合使用、融合發展成為未來乳品微生物檢測的趨勢。現如今的乳品檢測中，人們對智能化、小型化和便攜式檢測儀器的需求與日俱增，這些小型儀器可實現對乳品的現場檢測，它們的生產和研制成了今后乳品微生物檢測技術中的另一發展方向。乳品的質量安全與人們的身體健康和生命安全緊密相關，因此需要建立更加高效、靈敏、可靠的微生物檢測技術，也是保證中國乳品安全的前提[37]。