乳酸菌胞外多糖的分類及生物活性研究進展

文/黃承敏 陳 綺 游善兵 姚 慧 肖 茜 劉成國 周 輝＊

（1 湖南農業大學食品科技學院；2 湖南南山牧業有限公司）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是能夠利用可發酵糖，產生大量乳酸的細菌的統稱。作為公認安全的益生菌，LAB可促進腸道有益微生物的生長，對腹瀉、腸易激綜合征、過敏、乳糖不耐受、刺激反應等均有一定的治療功效[1]，因而在工業、農業、醫學等領域有著重要的應用價值。許多LAB的益生作用與其所產生的胞外多糖關系密切。胞外多糖（Exopoly Saccharides，EPS）是一些特殊微生物在生長代謝過程中分泌到細胞壁外、滲透到培養基中、易與菌體分離的一類多糖類化合物，對微生物的生長有著重要意義[2]。許多LAB的益生作用與其產生的EPS關系密切。

1 乳酸菌胞外多糖的分類

根據存在位置的不同，LAB EPS可以分為莢膜多糖和粘多糖兩類，但這兩類多糖結合在一起很難區分[3，4]。根據化學組成的不同，LAB EPS可分為同型多糖和雜多糖兩類。同型多糖是由1 種單糖組合而成的EPS，雜多糖則是由多種單糖組成的3～8 個重復單元所構成。大多數LAB所產生的EPS都是雜多糖，但在過去10 年，同型多糖卻是研究最為廣泛的一類EPS[5，6]。

2 LAB EPS的化學組成

EPS的主要組成成分是碳水化合物和蛋白質，也有一些EPS中還含有脂類、核酸或一些無機成分，這與EPS的分離純化方法和菌株的來源密不可分[7]。

同型多糖僅由1 種單糖聚合而成，故其組成成分較雜多糖更為簡單。同型多糖之間的差異主要體現在主鏈連鍵、分子量和側鏈結構等一級結構的不同，平均分子量通常在1.0×107Da左右。葡聚糖和果聚糖是其中最常見的兩種成分，通常由一個主鏈和不同分支度的支鏈構成。根據碳元素結合位點的不同，同型多糖可以分為α-D-葡聚糖、β-D-葡聚糖和β-D-果聚糖三種類型[8，9]。

與同型多糖相比，雜多糖的化學組成和結構則更為復雜，產量也更低。雜多糖的生物合成是在細胞質中進行的，分子量在1.0×104～1.0×106Da之間。線性或支鏈的單元組成了雜多糖，而這些基本的重復單元又是不同的單糖在酶的作用下通過α或β-糖苷鍵連接組成，如半乳糖、鼠李糖或葡萄糖。雜多糖有時會混有N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺或葡糖醛酸，甚至還可能存在磷酸基、乙酰基和甘油等其他糖殘基[10，11]。EPS的結構與其功能有著密不可分的聯系，分子量、重復單元和單糖組成、糖苷鍵連接類型、化學基團等因素是影響其功能的關鍵因素[12]，但對于何種結構決定何種功能則研究較少。

3 LAB EPS的生物活性

目前已有研究報道，LAB所產EPS具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調節等生物活性。

3.1 抗腫瘤活性

腫瘤的發生會經過一個復雜、多階段的過程，遺傳因素和機體自身免疫功能低下是其發生的主要原因。1982年Shiomi等[13]研究發現EPS具有抑制腫瘤活性后，就成為了眾多學者研究的熱點。

Oda等[14]研究表明，瑞士乳桿菌約古特亞種所產EPS具有抗腫瘤活性，其腫瘤抑制的主要機制是通過宿主介導的免疫應答而實現的。Vinderola等[15]發現馬乳酒樣乳桿菌具有抗菌、促進傷口愈合和抑制腫瘤生長等作用。Lee等[16]經過對雙歧桿菌丁醇提取物進行抗腫瘤活性分析，發現來自于青少年雙歧乳桿菌的肽聚糖、多糖片段和糖蛋白都具有腫瘤抑制作用，突出表現在對結、直腸癌的預防作用。 Ruas-Madiedo等[17]在研究乳酸乳桿菌乳油亞種KVS20的抗腫瘤活性時發現，向荷肉瘤小鼠S180腹腔中注入含有該菌EPS的菌體凍干物后，產生了抗癌效果，但只注射菌體則沒有此效果。

劉宇等[18]研究發現，德氏乳桿菌保加利亞亞種OLL1073R-1所產EPS不但具有調節胃腸道菌群組成、抗高血壓、降膽固醇等生理作用，還可以調節宿主抗腫瘤活性。邢書涵等[19]從藏靈菇中篩選出了一株產EPS的干酪乳桿菌KL1，將其所產EPS進行純化后研究其對HCT-8人結腸癌細胞的增殖抑制和誘導細胞凋亡作用。結果表明，純化后得到的單一組分EPSa具有阻礙HCT-8細胞增殖的作用，且細胞生長抑制率呈時間-劑量依賴關系。對細胞凋亡情況的探究發現，EPSa處理組的凋亡細胞明顯高于對照組，由此判斷，藏靈菇源干酪乳桿菌KL1菌株所產單一多糖EPSa可誘導HCT-8發生細胞凋亡，從而阻礙HCT-8細胞的增殖。

惡性腫瘤醫治的慣用有效方法為手術、放療、化療等，但這些手段往往在殺傷癌細胞的同時，還會對人體的正常組織產生毒性，造成許多嚴重的副作用。減少機體毒副作用、保護機體的正常免疫功能和殺傷腫瘤細胞在腫瘤疾病治療過程中具有同等重要的意義[20]。藥理及臨床試驗證明，EPS是一種可以作為免疫調節劑的化合物，能激活機體自身的免疫功能，且EPS自身具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等特點，使其應用于癌癥的輔助治療中，為腫瘤的治療提供了更安全的手段[21]。

3.2 抗氧化活性

相關研究發現，腫瘤細胞的形成和惡性轉移與過氧化緊密相關，所以EPS的抗氧化活性與腫瘤抑制活性也有著十分密切的聯系。具有高水平抗氧化作用的EPS一般也具有一定的腫瘤抑制活性，這或許是由于決定EPS抗氧化活性的特定結構與抗腫瘤活性的結構相似而產生的[22，23]。Kanmani等[24]研究發現，乳酸鏈球菌PI80代謝產生的EPS在體外對羥自由基和超氧化由基具有較強的清除能力。Xu等[25]對動物雙歧桿菌RH（Bifidobacteriumanimalis RH）所產EPS進行分離純化，得到一種重要的EPS組分EPSa，并發現當EPSa片段濃度達到0.2 mg/mL時，對1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）的清除能力與0.25 mg/mL的維生素C（VC）相當；且EPSa對脂質過氧化的抑制活性、對羥自由基（OH）及超氧陰離子自由基（O2-）的清除能力都明顯高于VC。

顏炳祥等[26]研究了硒化EPS的抗氧化能力，結果表明，硒化的EPS總抗氧化能力及對OH的清除活性較強，但對O2-的清除活性與未硒化的EPS相比，變化相差不大。熊強等[27]研究表明，來自植物乳桿菌Z22酸性多糖EPS-S和中性多糖EPS-Z都具有較好的自由基清除活性。其中EPS-S對DPPH的清除能力為27.75%，對OH的清除能力為66.16%、對O2-的清除能力達58.00%；而EPS-Z對這3 種自由基的清除率分別為24.02%、59.03%和45.20%，結果表明，酸性多糖比中性多糖具有更強的抗氧化能力。

蔡秋杏等[28]研究了腌干魚來源的LAB，發現LAB菌株的抗氧化能力越強，其在細胞內的抗氧化酶活性也越高，同時該菌株EPS產量、純度也更高，抗氧化能力也更強。劉雯雯等[29]在研究植物乳桿菌-12所產EPS對HT-29細胞增殖的抑制作用時發現，對HT-29細胞的抑制效果隨著EPS濃度的增加而增大；在植物乳桿菌-12 EPS的抗氧化試驗中發現，DPPH清除率與EPS濃度呈依賴關系，當濃度為0.5 mg/mL時，DPPH清除率能達到49.13%；在細胞凋亡試驗中，EPS濃度為500 μg/mL時，HT-29細胞凋亡數可達50.3 個。

3.3 免疫調節活性

大量研究表明，EPS具有免疫調節作用，能夠提高T淋巴細胞、B淋巴細胞的增殖能力，誘導細胞因子產生，并激活巨噬細胞的吞噬能力等[30]。然而并不是所有的EPS都具有免疫活化功能，其免疫活性因LAB菌株屬性的不同而有所差異，這種差異對活性EPS的結構也有影響。EPS的結構特點與免疫調節特性的關系主要表現在兩個方面：首先，含有負電荷側鏈結構的酸性雜多糖對免疫反應有很好的誘導作用；其次，體積或分子量大的雜多糖會抑制免疫反應的發生[31]。例如，酸性LABEPS的組成中含有磷酸根基團，所以大多能夠誘導免疫應答；敲除了EPS合成基因后，EPS較高分子量的天然EPS能夠更加有效的誘導TNF-α、IL-12、IL-10和IL-6等細胞因子的產生[32]。

李偉欣等[33]研究了一種雙歧桿菌代謝產生的EPS的免疫調節功能。結果顯示，低劑量的EPS可以誘導小鼠脾淋巴細胞增殖，并顯著提高小鼠血清半數溶血值HC50，增強小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬能力，表明此雙歧桿菌代謝產生的EPS對動物體內的特異性和非特異性免疫都有增強效果，具有一定的免疫調節活性。Ruas-Madiedo等[34]研究發現，動物雙歧桿菌亞種（B. animalis ssp.）lactis A1、IPLA-R1、長雙歧桿菌（B.longum）、NB667和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus GG）的EPS在1 mg/mL時能夠抵御體外真核細胞的細胞毒素，保護人體不受病原菌侵害。Kitazawa等[35]研究表明，分離自雙歧桿菌發酵液的EPS表現出較高的淋巴細胞免疫應答促進作用；保加利亞乳桿菌OLL1073R代謝產生的酸性EPS可以促進小鼠B淋巴細胞的有絲分裂。

4 展望

LAB作為發酵食品中常見的微生物，一直是食品微生物方向的研究熱點。隨著大量的LAB EPS被分離和鑒定，其生物活性不斷被揭示，在未來將會得到更廣泛的應用。目前困擾LAB EPS開發應用的關鍵問題是如何提高其產量，更好地降低EPS的生產成本。例如，采用一些物理、化學的誘變方法來篩選高產的突變體，增加EPS的產量。此外，基于對LAB EPS生物合成機制的認識，利用基因工程技術構建高產EPS的工程菌株，也是促進EPS工業化生產和應用的有力手段。另一方面，LABEPS的組成存在很大的差異性，即使同一種LAB，其代謝產生的EPS也存在菌株特異性。未來需要建立EPS組成與生物活性之間的構效關系，用于EPS的人工設計，更好地促進LAB EPS在食品、醫藥領域的應用。