基因工程乳酸菌作為活載體表達外源蛋白及疾病防治研究進展

劉 瓊，陳宏亮，姜延龍，王春鳳

(1.吉林工程技術師范學院食品工程學院，吉林長春130052；2.吉林農業大學動物科學技術學院 吉林省動物微生態制劑工程研究中心 教育部動物生產和產品質量安全重點實驗室，吉林長春130118

乳酸菌是一類可以發酵碳水化合物產生乳酸的兼性厭氧菌總稱，包括乳球菌、乳桿菌、鏈球菌、片球菌和雙歧桿菌等，美國食品和藥品監督管理局(FDA)將許多乳酸菌定義為“食品級”微生物，極少數如化膿性鏈球菌，肺炎鏈球菌是致病菌。乳酸菌可以調節腸道菌群組成從而維持腸道穩態，提高免疫力；還可競爭型地占位，定殖在腸道表面誘導黏膜液以及腸道上皮細胞抗菌肽(AMP)的產生[1]；在治療消化系統疾病(病毒性及細菌性腹瀉)、炎癥性腸病(IBD)和自身免疫性疾病中發揮了至關重要的作用。工程化的乳酸桿菌以其可食性，遺傳操作技術成熟簡便，效率高，重復性好等特點非常適合作為外源蛋白或藥物的遞呈工具。因此，利用基因工程乳酸菌遞呈抗原蛋白，無論在體外發酵還是在體內表達，都具有其他工程菌株無法比擬優勢，使其成為新型活載體用于多種病原微生物抗原及生物活性分子的表達，成為防治人及動物疾病的理想選擇。

1 基因工程乳酸菌載體/受體系統

1.1 基因工程乳酸乳球菌表達系統 乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)是典型模式菌，常用于食品發酵，抗原性弱，自身分泌蛋白較少，基本不在胃腸道內定植，早在21世紀初期，科研人員便開展了對乳球菌載體疫苗的研究。質粒消除菌株LactococcuslactisIL1403、LactococcuslactisMG136是最常用的宿主菌，基因組序列已經測出。隨著具有廣泛宿主范圍的乳酸菌復制子發現，派生出低拷貝質粒pIL252和高拷貝質粒pIL253，在此基礎上利用乳酸菌內源組成型或誘導型啟動子構建出表達載體/受體系統，其中乳鏈球菌素表達系統(Nisin controlled expression,NICE)最常用，乳鏈球菌素Nisin具有抗微生物活性，它的生物合成受到NisK和NisR雙組分調節系統控制，環境中存在Nisin時，Nisk可以識別Nisin，使NisR磷酸化從而激活NisA啟動子，轉錄下游基因。近年來又出現的一些較為高效的誘導表達系統，如鋅離子濃度調節的Zirex表達系統[2]、熱應激蛋白基因groESL啟動子所調控的壓力誘導性表達系統(Stress inducible controlled expression，SICE)[3]。

1.2 乳酸乳桿菌表達系統 隨著人們對乳桿菌的研究日益增多包括：鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌以及加氏乳桿菌等，乳桿菌屬因為高基因多樣性使表達載體的制備非常困難，只有在特定的菌株內才有適合的配套質粒復制系統。最常用的植物乳桿菌，嗜酸乳桿菌，加氏乳桿菌的質粒復制子分別為pWV01、pSH71和pAMbeta-1。乳桿菌質粒表達載體構成中既有組成型的啟動子如磷酸甘油酸變位酶啟動子Ppgm、乳酸脫氫酶啟動子Pldhl和S層蛋白啟動子PslpA，也有誘導型啟動子。隨著國內外對乳酸桿菌基因組的研究，已經鑒定出多種環境誘導型啟動子，并應用于報告基因的表達，常見的是腸球菌熱休克蛋白啟動子，它的活性在植物乳桿菌中已得到檢驗[4]，以嗜酸乳桿菌為宿主的糖誘導表達系統如：低聚果糖啟動子PFOS， 乳糖Plac和海藻糖 Ptre，還有pH值誘導表達系統、噬菌體誘導表達系統、溫控誘導表達和清酒乳桿菌素誘導表達系統。

1.3 外源蛋白的定位表達 乳酸菌質粒表達載體可定向運輸其表達的外源蛋白，根據蛋白與宿主菌的相對位置，將外源蛋白的表達情況分為胞內表達，胞外分泌表達及菌體表面錨定表達。乳酸菌作為活載體的免疫效果受到外源蛋白表達位置、免疫途徑、免疫程序、受體菌株種屬及抗原的表達量影響，尤其是抗原的表達量直接影響免疫水平和免疫類型。迄今為止，外源抗原蛋白在乳酸菌宿主細胞上的最有效定位還沒有明確定論。大量的外源蛋白表達在胞內會使細胞致死或是抗原集中降解，而且在細胞內表達的外源抗原不能充分地與黏膜免疫系統接觸而影響免疫應答效果是目前科研工作者亟待解決的一個主要問題。近期的研究結果證明，將外源蛋白錨定表達在宿主細胞表面是活載體疫苗向黏膜免疫系統提呈抗原的最有效方式，因此對乳酸菌錨定表達系統的深入研究對提高疫苗的效果具有重要的實踐意義。

外源蛋白在菌體表面定位表達方面，本研究室的劉瓊以pW425et為基礎載體利用嗜酸乳桿菌S-層蛋白基因構建了錨定表達系統pW425et-S[5]，蔡若鵬將來源于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)聚-γ-谷氨酸合成酶A(Poly-γ-Glutamic Acid Synthetase A，pgsA)基因截短連接在誘導型表達載體pSIP409啟動子之后，獲得錨定表達載體pSIP409 pgsA′，該載體可將EGFP和IL-10錨定在植物乳桿菌表面[6]。在此研究基礎上，2016年周芳玉[7]及2017年Jiang等人分別以錨定表達載體pSIP409pgsA 和pSIP409 pgsA′成功表達雞柔嫩艾美耳球蟲EtMIC2基因和禽流感病毒H9N2亞型HA2蛋白，獲得的工程菌口服免疫雛雞具有中等的抗球蟲效果，錨定表達含有HA2蛋白和佐劑分子LTB的植物乳桿菌可以顯著地提高免疫小鼠的抗禽流感病毒能力[8]。

1.4 載體的無抗性選擇標記 區分細胞是否含有重組質粒要用選擇標記進行篩選，行之有效且應用較多的是抗生素抗性標記，如紅霉素、氯霉素等，但隨著人們對食品安全的重視日益增強，抗性基因漂移將會給人類和環境帶來嚴重的危害。經過幾十年的研究，科學家們研究發現一系列代替抗的篩選標記，主要包括糖類、細菌素、營養互補、金屬離子選擇標記等。營養互補選擇標記主要包括嘧啶和氨基酸營養互補選擇標記。王春鳳利用胸腺嘧啶核苷酸合成酶 (thyA)基因替代穿梭載體pW425e中的紅霉素抗性基因，得到了以thyA為選擇壓力的非抗性質粒載體pW425t，達到非抗性篩選陽性重組體目的[9]。

2 基因工程乳酸菌作為活載體表達外源蛋白防治疾病的應用

2.1 抗病原微生物 大多數乳酸菌疫苗研究都集中在乳酸乳球菌，也有部分研究是關于植物乳桿菌，嗜酸乳桿菌，干酪乳桿菌以及枯草芽孢桿菌。其中，植物乳桿菌屬的幾種典型菌株，具有耐酸耐膽鹽，在腸道內吸附和定殖的能力，同時競爭性地抑制病原微生物的定殖。與乳球菌相比，植物乳桿菌存在的最大問題是蛋白表達的水平偏低，蛋白表達低就不能引起足夠強度的免疫反應，不能提供對疾病的有效保護。所以，為了提高抗原的表達濃度，設計組成型的啟動子，便成為一種解決方案，S層蛋白slpA啟動子就是一個很好的應用。李一經等，以乳酸乳球菌分泌表達型載體pPG612為基礎載體，用短乳桿菌S層蛋白啟動子slpA構建組成型表達載體，以豬傳染性胃腸炎(TGEV)的N蛋白基因為目的基因檢測slpA啟動子在3種不同乳酸桿菌中表達能力，表明此啟動子具有嚴格宿主選擇性，在植物乳桿菌中活性最好、表達量最大，在重組干酪乳桿菌L393次之，在重組副干酪乳桿菌中最差[10]。

此外，將抗原和佐劑分子聯合應用，也是一種增強疫苗效率的方法。2011年，Andersen等[11]用乳酸桿菌表達單鏈抗體，在胃腸道對炭疽桿菌毒素進行中和，產生免疫保護。2015年Katarzyna等利用人植物乳桿菌錨定表達HIV-1Gag派生抗原與趨化因子CCL3融合蛋白，體外實驗使T細胞募集作用增強[12]。

在增強乳酸菌疫苗載體免疫效果的相關研究方面，本研究室Yang等將H9N2型禽流感病毒的保守抗原NP、M1與靶向樹突狀細胞誘導肽(DCpep)融合，重組到植物乳桿菌NC8中，表明NP-M1-DCpep的乳桿菌可以誘導強烈的細胞免疫應答與黏膜免疫應答，顯著地提高黏膜sIgA與IgG的抗體水平，從而對抗H9N2型禽流感的感染[13]；Jiang等[14]將新城疫病毒(NDV)保護性抗原HN蛋白基因與DCpep相融合，用植物乳桿菌NC8為遞送載體，發現重組菌能夠顯著提高雛雞HI效價水平，誘導黏膜免疫應答，產生效應細胞，抵抗NDV的攻擊。

2.2 抗IBD IBD病因尚不明確，主要表現為腸道炎癥性紊亂，乳酸菌可以減輕腸道炎癥，用乳酸菌治療IBD具有獨特的優勢。此外，經口服途徑進入機體的重組乳酸菌疫苗，引起黏膜與全身免疫應答，會增加IBD的防治效果。低鈣V抗原、TNF-α納米級抗體、三葉因子、過氧化氫酶和IL-10，都能夠用乳酸乳球菌載體在患病動物模型體內成功地表達，通過口服給藥的方式，黏膜水平上遞送治療性藥物，是取得良好療效的關鍵因素。可分泌IL-10的重組乳酸乳球菌活載體疫苗已經進行到藥物臨床試驗階段，用以治療克羅恩病，但是從目前得到的臨床結果來看，由于腸道內IL-10的濃度偏低，試驗以失敗而告終。所以，研究人員最近用乳酸菌表達IL-27，在抑制炎癥的同時又可以誘導IL-10的表達[15]，在IBD小鼠模型中降低該病的發病率。彈性蛋白酶抑制劑，一種內源性蛋白酶抑制劑，在IBD患者體內，彈性蛋白的含量下降，而彈性蛋白在健康人腸道內發揮了抗炎的功效，分別用乳球菌和干酪乳桿菌載體表達此蛋白，在IBD模型小鼠體內進行評價結果發現可以降低彈性蛋白離解活性，緩解炎癥[16]。

2.3 乳酸菌與糖尿病 針對Ⅱ型糖尿病的胰島素替換療法尚有不足，一是胰腺β細胞被自身免疫應答所損傷；二是注射胰島素不能阻止并發癥。因此，運用乳酸菌活載體治療Ⅰ型與Ⅱ型糖尿病，是近幾年采用的新免疫療法。2011年Ng和Sarkar[17]發現，可分泌胰島素類似物的重組乳酸乳球菌在體外實驗可增強脂肪細胞的生物代謝功能。2014年，Agarwal等[18]通過基因工程乳酸乳球菌載體遞送胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，在Ⅱ型糖尿病大鼠模型體內完成評價，口服重組菌的給藥方式，與注射GLP-1的給藥方式相比，大鼠血糖水平下降，同時胰島素含量升高，抗病機理還有待進一步研究。

Ⅰ型糖尿病是以自身反應性T細胞對胰島β細胞進行性破壞為主要特征的自身免疫性疾病。胰島素和胰島素原是該病的重要抗原，胰島素自身抗體在高風險病人體中廣泛存在。針對Ⅰ型糖尿病，2014年Robert等利用重組前胰島原谷氨酸脫羧酶GAD65370-575+IL10的乳球菌加上低劑量的抗 CD3 單克隆抗體聯合治療新診斷發病的NOD 小鼠取得了很好的效果[19]。2015年Robert等利用乳球菌將Ⅰ型糖尿病的兩種主要抗原谷氨酸脫羧酶(GAD65)和酪氨酸磷酸酶樣蛋白ICA512(IA-2)與IL-10共分泌表達，在糖尿病小鼠模型中得到了較好的治療效果[20]。

2.4 抗癌癥 癌癥與人類健康密切相關，世界范圍內癌癥的發生率也在不斷上升，利用乳酸菌來防治癌癥是近年來出現的一種新的嘗試。在直腸癌小鼠模型實驗結果來看，雙歧桿菌，干酪乳桿菌，長雙歧桿菌，嗜酸乳桿菌，鼠李糖乳桿菌和費氏丙酸桿菌均呈現出明顯的降低癌癥發展功效。雖然體外和動物模型試驗某些菌株表現出較好的抗癌效果，但目前還沒有關于人的臨床試驗研究。

通過靜脈注射的方式，某些食品級的乳酸菌進入動物機體后，可以抵達固體腫瘤的附近，并可以積聚和繁殖。這個現象可能與腫瘤內部的低氧環境有關，在這樣的缺氧環境中，厭氧細菌就可以選擇性地生長。于是，研究人員利用長雙歧桿菌重組胞嘧啶脫氨酶，通過靜脈注射去治療乳腺癌。另一個應用是將內皮抑制素重組雙歧桿菌，靜脈注射給腫瘤小鼠模型，結果表明，重組菌可以選擇性抑制血管生成和腫瘤生長。

近年來，研究人員嘗試利用重組乳球菌表達16型人乳頭狀瘤病毒E7蛋白(HPV-16 E7)治療宮頸癌，其中利用NICE表達系統表達重組E7蛋白在動物實驗上的結果表明，重組菌可以引起腫瘤體積輕微減少和特異性免疫應答反應。Rangel-Colmenero等[21]將E7蛋白與鈣網蛋白融合表達，發現對腫瘤的抑制率大于80%。在利用基因工程乳酸菌抗癌癥方面，本研究室Hu等[22]從酸奶中分離得到鼠李糖乳桿菌與植物乳桿菌，植物乳桿菌能抑制小鼠結腸癌，他們還利用植物乳桿菌NC8重組新城疫病毒HN基因，檢測重組乳酸菌對小鼠結腸癌的抑制作用，結果發現，重組菌通過促進NK細胞的增殖活化，誘導樹突細胞的成熟，促進毒性T細胞的殺傷活性，發揮抗腫瘤的作用。

2.5 抗寄生蟲病 利用基因工程乳酸菌活載體表達寄生蟲的保護性抗原來防治寄生蟲疾病，在解決寄生蟲病疫苗防治困難的同時也可以減少藥物的使用，降低動物性食品中藥物殘留，本研究室開展深入系統研究，Yang等[23]用植物乳桿菌載體NC8融合表達柔嫩艾美耳球蟲SO7基因與DCpep串聯，發現表達SO7- DCpep的重組菌可以有效地降低雛雞盲腸病變，具有良好的保護效果；Yao等[24]利用植物乳桿菌載體NC8，表達金魚小瓜蟲抑動蛋白IAG-52X，發現重組菌可以引起金魚血液與皮膚中抗體水平顯著升高，IgM、補體和MHC-I類分子的表達量顯著升高，金魚的存活率也有所升高。

3 展望

目前利用基因工程乳酸菌已表達多種細菌、病毒抗原及生物活性分子[25]，動物試驗表明，能夠誘導機體產生免疫應答，從而增強動物抗病能力，達到預防和治療疾病的目的。然而基因工程乳酸菌制劑在商品化之前還有許多需要解決的問題：(1)標記基因，用于構建基因工程乳酸菌的諸多載體無論是質粒載體還是染色體整合載體大部分還是以紅霉素、氯霉素等抗生素為篩選標記，在實際應用時存在抗性基因的轉移安全隱患，無抗性篩選標記是未來研究的主要方向；(2)宿主菌選擇，乳酸菌具有較高的生物學與遺傳基因型多樣性，相同基因在不同宿主菌中表達水平也有所差異，刺激細胞引起的細胞免疫和體液免疫也不同，應根據研究目的不同而選擇合適的宿主菌株；(3)免疫耐受，外源蛋白表達量低是乳酸菌作為表達系統的一個普遍問題，乳酸菌長期在消化道內表達的抗原蛋白能否引起機體免疫耐受，引起的免疫耐受如何解決也是未來研究的重要方向；(4)載體開發，乳酸菌已經實現多種外源蛋白的體外表達，但在腸道內蛋白的表達情況及生物活性仍無法準確檢測，因此，需要開發新的表達系統將外源蛋白在乳酸菌中的表達準確定位，將抗原暴露實現對黏膜免疫系統的精準遞呈；(5)免疫機理方面，盡管重組乳酸菌能夠誘導產生特異的免疫應答，達到很好的免疫效果，但是不同種屬的細胞壁成分不同，而有些細胞壁的組成恰好是模式識別受體TLR樣受體或者NOD樣受體在抗炎反應中識別的成分，乳酸菌在調節天然免疫通路，提高自身免疫的機理尚未闡述。乳酸菌作為宿主菌將外源蛋白錨定表達，是遞呈抗原的最有效方式，因此如何提高蛋白錨定表達量及實現兩種或3種外源蛋白同時錨定表達，并采用無抗性篩選標記對乳酸菌錨定表達系統深入研究，是未來乳酸菌作為載體遞呈抗原的主要研究方向。隨著分子生物學、基因功能和免疫機制更深入的研究，基因工程乳酸菌必將具有更廣闊的應用前景。