雞球蟲抗藥性檢測方法研究進展

畢菲菲,韓貞艷,郝振凱,于詠蘭,索 勛,劉賢勇

(中國農業大學動物醫學院,北京海淀100193)

1 雞球蟲及雞球蟲病

艾美耳屬(Eimeria)球蟲隸屬頂復門、真球蟲目、艾美耳科[1]，廣泛寄生于雞、兔、鴨和鵝等動物的腸道或肝臟、腎臟等部位[2]。寄生于雞腸道內的艾美耳球蟲有7個種，分別是柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)、堆型艾美耳球蟲 (E.acervulina)、毒害艾美耳球蟲 (E.necartrix)、巨型艾美耳球蟲 (E.maxima)、和緩艾美耳球蟲(E.mitis)、布氏艾美耳球蟲(E.brunetti)和早熟艾美耳球蟲(E.precox)[3]。雞球蟲病對養禽業危害極大。據報道,全世界每年用于抗球蟲藥的費用及因球蟲病暴發造成的經濟損失達24億美元[4]。

2 球蟲抗藥性

自20世紀40年代以來，多種藥物被嘗試用于防治雞球蟲病。而自1945年開始，美國學者就從田間分離到了對磺胺類藥物具有抗藥性的蟲株[5-6]；到了20世紀60年代，則相繼發現針對不同藥物的不同抗藥株[7]。孔繁瑤等[8]1994年首次報道我國12個地區都普遍存在柔嫩艾美耳球蟲抗藥株之后，全國各地相繼報道出現抗藥蟲株。迄今為止，幾乎所有的抗球蟲藥均有抗藥蟲株出現，且抗藥蟲株表現出對與該藥同類或作用機理相同的其他藥物一定程度的交叉抗藥性[9]。

寄生蟲抗藥性一般被認為是藥物控制寄生蟲的失敗，但抗藥性的廣義定義是對藥物敏感性的轉變[10]。針對所有生物而言，抗藥性是“在使其他細胞毀滅或抑制的藥物作用環境下，一個細胞及其后代仍然能暫時或長期生存或繁殖的能力”[11]。球蟲學家Chapman博士則認為抗藥性是對存在于球蟲群體中突變體定向選擇的結果[12]，這為我們進行抗藥性機制研究提供了很好的思路。

3 抗藥性的檢測方法

3.1 雞體試驗法 目前檢測雞球蟲抗藥性常用的方法是雞體試驗法，此方法是將供試藥物按一定濃度飼喂雞只，經一定時間后接種雞球蟲孢子化卵囊，然后通過不同的抗藥性檢測指標單獨或聯合來判定球蟲的抗藥性，常用的評價指標有如下幾個。

3.1.1 相對卵囊產量(Relative oocyst production, ROP) 按照藥品說明書配置藥物并用于相應的組別。投藥48 h后，每只雞經口接種1×104～1×105個孢子化卵囊并收集感染后96～168 h的糞便。使用改良麥克馬斯特計數板計算樣品中的總卵囊量。計算公式：ROP=(感染給藥組平均卵囊產量÷感染不給藥組)×100%。

3.1.2 病變記分減少率(Reduction of lesion scores, RLS) 球蟲感染后第6天或第7天撲殺試驗雞，按Johnson[13]等所述方法進行病變記分。計算公式：RLS =(感染不用藥對照組平均病變記分-感染用藥組平均病變記分)/感染不用藥對照組平均病變記分×100%。

Mcdougald L[14]等以感染用藥組與感染不用藥組的病變記分計算出用藥組病變記分減少率，用其判定球蟲對藥物的抗藥性或敏感性。Jeffers[15]以感染用藥組的平均盲腸病變記分大于或等于感染不用藥對照組的50%作為對莫能霉素抗藥性的標準，檢測了美國73個雞場柔嫩艾美耳球蟲分離株對1×10-4g/kg莫能霉素的敏感性，結果證明均無抗藥性。

3.1.3 最適抗球蟲活性(Optimum anticoccidial activity, POAA) 評價抗球蟲藥物效果最有用的標準是感染急性期的體重增加。從接種當天到第5天或第6天或在最大生長抑制期間測量體重的增加。計算公式：最適抗球蟲活性POAA=(感染用藥組增重-感染不用藥組增重/不感染不用藥組增重-感染不用藥組增重)×100%。

Mcdougald L[14]等比較了接種后第6天試驗期內感染用藥和感染不用藥對照組的增重，結果顯示，感染用藥組與不感染不用藥對照組、感染不用藥對照組增重的差異較顯著。

3.1.4 綜合判定 以POAA≤50%判為+，>50%為-；RLS<50%判為+，RLS≥50%為-；ROP≥15%判為+，ROP<15%為-。

判斷標準為 ---為敏感，--+為輕度抗藥，-++為中度抗藥，+++為嚴重抗藥。

用上述指標，劉穎[16]等初步確定了柳州市區域性雞球蟲的抗藥性；姚惠娟[17]等發現野外混合球蟲對地克株利、馬杜拉霉素、氯羥吡啶、鹽霉素4種抗球蟲藥完全抗藥；謝婷[18]等發現河池市分離的雞球蟲對磺胺喹噁啉鈉中度抗藥，對地克珠利和鹽酸氯苯胍完全抗藥。

3.2 同工酶分析測定法 同工酶分析法是根據敏感蟲株與抗藥蟲株同工酶譜的不同，先確定某種藥物的抗藥蟲株特異性同工酶譜，再將田間分離的蟲株進行同工酶分析，比較分離株和抗藥株的酶譜， 根據二者差異是否顯著而判斷是否產生了抗藥性[19]。國外學者利用葡萄糖磷酸變位酶(PGM )作為遺傳標記分析了巨型艾美耳球蟲中苯甲氧喹啉抗藥性因子的轉移情況[20]。

3.3 超微結構比較法 具有抗藥性的蟲株，其超微結構會發生相應的變化，以避開藥物作用的位點。比如，莫能菌素在離體條件可顯著影響球蟲敏感蟲株的超微結構，致其裂殖子膨脹、細胞漿空泡化、細胞膜結構模糊、破損和細胞整體形態發生改變[21-22]。

3.4 RAPD測定法 隨機擴增多態性DNA (Random amplified polymorphic DNA, RAPD)是一種以PCR為基礎的基因分析方法。該方法用單一或多個隨機核苷酸序列作為引物，對基因組DNA進行擴增，避免了PCR特異性引物設計上的困難，尤其在對未知樣本的鑒定方面，顯示了其獨特的特點[23]。

4 展望

目前雞球蟲的抗藥性檢測方法仍無統一標準，用來檢測球蟲抗藥性的方法各存在優缺點。隨著各位學者研究的不斷深入，在常用方法的基礎上，發展出了更多的檢測雞球蟲抗藥性的方法，現代分子生物學技術，如RAPD 技術、RT-PCR法是較為精準的檢測方法，具有廣闊的應用前景。

隨著生物化學，細胞生物學以及分子生物學等技術的發展，同時對球蟲生物學特性、代謝機制和耐藥機制的解析，有目的地開發高效、低毒、廣譜的抗球蟲新藥，以及提取中草藥有效成分，研制安全、有效的基因工程苗和核酸疫苗，更好地了解艾美耳球蟲的動物流行病學，藥物的作用方式和對它們的抗性機制以及免疫機制，將有助于改進控制雞球蟲病的方法。