偽狂犬病病毒致病機理與防控技術研究進展

路金金，王曉佳

(中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193)

豬偽狂犬病病毒(PRV)又稱豬皰疹病毒I型、奧耶斯基氏病毒，具有嗜神經組織性，可導致新生仔豬致命性腦炎、生長育肥豬呼吸系統疾病和母豬繁殖障礙，給全球養豬業帶來了嚴重的經濟損失。PRV作為典型的皰疹病毒，常被用作基因治療、腫瘤治療，以及神經元電路示蹤的研究工具或模型。PRV可感染多種動物，除了豬、牛、羊、犬和貓外，還有野生動物和肉食動物也易感染。2018年6月“華山戰狼團隊”暴出了PRV感染人的病例[1]，這震驚了國內外學者。于此同時，趙偉麗等將2016年12月至2017年12月間北京協和醫院神經科的樣品進行檢測，確診4例PRV病例，患者均是從事生豬及生豬肉產銷的人員，其腦炎、視網膜炎等癥狀明顯[2]。這提醒我們，PRV已跨越物種屏障而感染人類，對全球公共衛生造成嚴重威脅！人們必須重新認識PRV，提高防控意識，在危害擴大之前及時遏止該病毒的突變與傳播速度。

流行病學調查表明，PRV及其變異株在我國多個省市廣泛出現，且流行區域有擴大的趨勢，給我國豬偽狂犬病的凈化帶來嚴峻挑戰。本文從PRV流行病學、分子致病機理、疫苗與抗病毒制劑3個方面，將近幾年的研究進展進行綜述，為該疫病的綜合防控提供科學資料與有效策略。

1 流行病學

PRV有廣泛的宿主群，然而易感動物中只有豬是PRV的貯存宿主，各階段的豬均可被感染，其中以兩周齡的仔豬癥狀最為嚴重，死亡率高達100%。隨年齡的增長，病死率逐漸下降，成年豬常呈隱性感染或潛伏感染，在外周神經系統終生攜帶該病毒，并將其傳播給其他動物。PRV可通過呼吸道、消化道、垂直傳播、配種、輸精等途徑直接傳播，也可通過接觸被病豬、帶毒豬或其排瀉物、流產胎兒等污染的用具、飼料、飲水等媒介物間接傳播。不表現明顯臨床癥狀的隱形感染豬是豬場PRV暴發的重要因素，病豬、康復帶毒豬和帶毒鼠也是重要傳染源。成熟PRV在感染其自然宿主豬的過程中，首先侵入豬表面黏膜的上皮細胞，之后進入神經纖維末梢，最后入侵外周神經節和中樞神經系統[3]。

豬偽狂犬病一年四季均可發生，較易發生在寒冷的春冬兩季。1990-2011年間，經典疫苗株Bartha-K61(gE基因缺失苗)安全有效地控制了PRV在我國的傳播。2011年下半年出現Bartha-K61株疫苗免疫過的豬群中暴發偽狂犬病的報道，研究發現PRV出現了變異，經典疫苗株不能再為其提供完全的保護，這給我國養豬業敲響了警鐘。2013-2016年間有學者在山東省跟蹤了395例臨床案例和收集了5 033份豬血清樣本。經檢測395例樣品中110例為PRV gE基因陽性，并從其中分離到了15種PRV變異株；收集的5 033份豬血清樣本中，57.8%呈現PRV gE抗體陽性[4]，這表明PRV變異株在山東省豬場普遍存在。也有學者分析了2013-2016年間PRV變異株在我國各地繁育豬場的流行情況，發現PRV變異株陽性率在我國總趨勢是逐漸下降的(從22.17%降至13.14%)，不同地區間有所差異[5]。PRV血清型單一，不斷出現新的傳播能力和毒性都增強的變異株，毒株間毒力和生物學特性差異明顯。毋庸置疑，PRV變異問題需要被學界與業界充分關注，各大規模化豬場對偽狂犬病的控制與凈化做出規劃。

2 致病機理

PRV病毒屬于皰疹病毒科，甲型皰疹病毒亞科，水痘病毒屬，病毒呈圓形或橢圓形，直徑為150～180 nm。PRV成熟的病毒顆粒由4種形態上不同的結構構成：包含著病毒線性雙鏈DNA基因組的核仁、包裹著核仁的保護性二十面體核衣殼、由蛋白質基質形成的殼皮，以及包裹著殼皮并含有幾種病毒糖蛋白的脂質膜構成的囊膜[6]。PRV基因組為線性雙鏈DNA，長度約為150 kb，其中G+C平均含量達74%。2004年Klupp B G等完成了PRV基因組基因序列的測定[7]，極大地推進了學者們對PRV基因及蛋白功能的進一步研究。2006年Pomeranz L E 等統計，PRV基因組由72個閱讀框組成，可編碼70種蛋白質[8]。近年來對PRV病毒與宿主細胞的相互作用研究越加深入，為病毒致病機制的研究奠下扎實的基礎。

2.1 基因組US/UL獨特區域 皰疹病毒基因組分為6級，用字母A-F表示，PRV基因組同水痘帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)一樣屬于D類，特征在于存在長獨特(Unique long,UL)與短獨特(Unique short,US)區域，其中US區位于內部重復序列(IRS)和末端反向重復序列(TRS)兩側。UL和US線性排列長度分別為110 kb和9 kb，在基因組中與IRS和TRS共同形成UL-IRS-US-TRS的序列。早期的學者根據試驗數據建立了良好的基因組圖譜，將UL內不同的基因片段依次命名為UL1-UL54，將US內的基因依次命名為US1-US9。

皰疹病毒衣殼的出核由保守的核出口復合物(Nuclear egress complex,NEC)介導，其由膜錨定的pUL34及其核質相互作用配偶體pUL31組成。2014年Pa?vogel L等鑒定出pUL34中兩個天冬酰胺殘基(N75,N103)和一個二亮氨酸基序(LL166 / 167)是維持NEC功能所必需的。pUL34-N75A突變體不能與pUL31相互作用，而pUL34-N103A突變體則失去功能[9]。Zhang R等研究表明pUL50不僅具有dUTP酶活性，還能通過促進IFN受體的降解而抑制Ⅰ型干擾素通路，從而有助于PRV逃脫宿主的免疫消除[10]。Zhao H等發現，pUL56和豬白細胞抗原1類分子相互作用可導致后者泛素化程度加強，也可能與免疫逃避有關[11]。Richards A L等發現，UL37表達的蛋白表面R2區有一種神經侵襲性效應器，該區域突變會導致PRV失去沿軸突逆向傳播到動物外周神經節的能力[12]。Ye C等構建UL41缺失變異株，與野生型相比，該變異株體外的增殖能力和體內的神經侵襲性均受損[13]。這些發現為一種新型弱毒活疫苗的研發提供了方向。

2009年有學者提出US3表達蛋白pUS3激酶活性是肌動蛋白細胞骨架調整所必需的[14]，而pUS3激酶誘導的細胞骨架重排和細胞延伸，與病毒向周圍細胞的擴散密切相關[15]。2015年Jacob T等進一步證明，pUS3表達可導致PKA依賴性RhoA 磷酸化，而這有助于pUS3誘導的肌動蛋白細胞骨架重排[16]。最近Lyu C等用豬大腦皮層原代培養系統培養US2缺失型PRV，發現與野生型PRV相比，病毒的滴度反而較高[17]。這為深入了解PRV致病機理提供新數據。

2.2 病毒編碼miRNA 微小RNA(microRNA,miRNA)是一種含22～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，主要參與轉錄后的基因調控，在所有植物和動物中都表達，包括DNA病毒。目前發現的病毒miRNA多來自皰疹病毒，這是由于皰疹病毒基因組較大，單個病毒就能編碼出大量的miRNA(一些成員能表達超過30種miRNA前體)。這些miRNA通常成簇聚集在皰疹病毒基因組中，存在于潛伏相關轉錄物(Latency-associated transcript,LAT)基因座內或其附近。研究表明，LAT基因座中miRNA簇的缺失，會影響PRV在豬三叉神經節內建立潛伏期后引起的宿主應答[18]。最近發現，miRNA在皰疹病毒的感染中發揮著基因調控作用，miRNA簇與PRV病毒的復制與毒力密切相關[19]。

2.3 病毒糖蛋白 目前已有11種PRV糖蛋白被報道，分別為gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN。2011年接種過PRV疫苗的豬群中暴發了高致病性偽狂犬病病毒變異株ZJ01的感染，其較強的毒力被證明與gE和gI的變異相關[20]。漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)在抗病毒免疫反應中起重要作用，這類細胞能夠產生大量的I型干擾素(TI-IFN)。而Lamote J A等指出gE / gI糖蛋白復合物等夠抑制pDC產生TI-IFN[21]。Tang Y D等構建了病毒基因gE、gI、gG、gN、gM、US2、US9、US3、早期蛋白0(EP0)分別缺失的突變病毒，發現糖蛋白gM突變體的病毒毒力明顯下降[22]，表明gM對PRV的毒力至關重要。

PRV病毒入侵過程中，gD介導與宿主細胞表面的受體結合后，gH和gL形成異二聚體激活gB，從而促進病毒囊膜與宿主細胞膜融合。研究表明，gH的N末端多糖對gH的功能有顯著的調節作用，但這種調節作用不是必需的[23]，而gH 的跨膜錨定結構域是gH發揮功能所必需的[24]。此外，Zhi-qing Yu等發現gB具有良好的免疫原性[25]，這為靶向gH與gB設計抗病毒阻斷劑提供新資料。

2.4 宿主細胞應答 在PRV感染所引起的天然免疫應答中，I型干擾素及其受體依賴性免疫穩態調節是宿主防御所必需的，IFN-α/β受體缺乏會增加機體對PRV的易感性[26]。ISG15是一種天然免疫中刺激IFN產生的泛素樣蛋白，參與IFN-β介導的天然免疫應答，然而PRV可通過干擾豬體內ISG15的表達來抵制其介導的抗病毒作用[27]。同時，PRV感染細胞后能誘導細胞自噬水平增加，其程度與病毒的毒力成正相關，表明自噬對于病毒復制非常重要[28]。此外，毒性PRV感染機體能發生特異性的全身性炎性反應，這種炎性反應可導致小鼠死亡[29]。核苷酸內焦磷酸磷酸二酯酶(Ectonucleotide pyrophosphotase/ phosphodiesterase,ENPP1)與GMP-AMP循環合酶(Cyclic GMP-AMP [cGAMP)] synthase,cGAS)協同作用維持cGAMP含量的穩定并參與PRV的感染。感染PRV的細胞中，NEPP1過量表達則PRV的感染程度增強，提示其是重要的病毒作用靶位[30]。這些進展為進一步揭示該疫病致病機理提供了新思路。

3 PRV新型防控技術進展

3.1 新型疫苗 疫苗免疫接種仍是我國控制PRV發生的首選措施。1970年我國從匈牙利引入偽狂犬病疫苗Bartha-K61株，自1990年國內廣泛使用該疫苗以來，我國豬偽狂犬病得到了有效的控制。然而，2011年后半年，PRV變異株開始大范圍地出現。Bartha-K61株屬基因型Ⅰ型，而近幾年我國流行的PRV變異株形成了另一個獨立的基因型分支即基因型Ⅱ型，我國的經典疫苗株已不能再為其提供完全的保護。新型PRV疫苗的研究在我國緊密展開。2016年Wang J等用PRV AH02LA株構建gE基因缺失的PRV LA-LB感染克隆，將其輔以佐劑制備成滅活疫苗免疫3周齡的PRV陰性仔豬。結果表明，在PRV攻毒后，該滅活疫苗不僅能明顯減少病毒脫落，且能提供完全的臨床保護[31]。2017年Yin Y等利用同源DNA重組，在PRV的變異株XJ株基礎上去除gE/gI，構建了一個新的弱毒疫苗株rPRV XJ-delgI/gE-EGFP。用該弱毒疫苗免疫斷奶仔豬，免疫后仔豬沒有表現出任何臨床癥狀，并在體內檢測到了高水平的gB特異性抗體。28天后用PRV變異株FJ攻毒，除了輕微發燒外沒有任何其他臨床癥狀，而沒有免疫該弱毒疫苗的仔豬出現典型的臨床癥狀并在5天內全部死亡[32]。同年Jing D等進一步去除TK基因，構建TK/gE/gI三基因缺失苗。與雙基因缺失苗相比，三基因缺失苗免疫豬具有較低的致病性和更高的保護力，是我國預防PR的理想候選疫苗株[33]。

此外，Liang C等還采用體外高溫傳代的方法，將PRV變異株JS-2012在Vero細胞中40 ℃條件下持續傳代到第120代，獲得PRV減毒株JS-2012-F120，該減毒苗免疫仔豬可保護仔豬免受經典毒株和新出現強變異毒株的攻擊[34]。

3.2 抗病毒阻斷劑 針對PRV的治療，目前尚無特效藥。在發病早期應用抗偽狂犬病病毒高免或丙種免疫球蛋白效果較好，但若已開始出現神經癥狀則效果不佳。目前國內外學者將PRV的新藥開發提上日程，希望為緊急治療提供資料。近年來研究表明，PRV在感染細胞的過程中能夠借助DNA聚合酶輔助亞基UL42蛋白來進行細胞內定位，Changjie Lv等針對此機理發現伊維菌素通過靶向UL42蛋白核定位信號而具有抗PRV作用[35]。2014年魏子貢等人研發了一種抗PRV增殖的重組蛋白，可顯著抑制病毒感染宿主細胞[36]。2017年Li X等針對gB鑒定出15中具有良好中和病毒活性的單克隆抗體，其中14種單抗靶向PRV gB的結構域IV并通過補體效應阻斷病毒進入細胞；另1種單抗可識別gB結構域I，阻止病毒入侵且不依賴于補體作用[37]。2018年Zhao X等發現白藜蘆醇能夠抑制PRV的復制，減輕病毒感染引起的炎癥，因此可明顯降低PRV感染仔豬的死亡率，同時改善其生長性能[38]。天然產物具有抑制病毒復制、調節免疫反應等功效，靶向宿主細胞的抑制物亦可最大限度地減少耐藥性可能。而多靶位抗病毒制劑的聯用有望進一步安全、有效地發揮病毒防治效果。

4 展望與現狀

隨著對PRV研究的持續關注與推進，近年來偽狂犬病的綜合防控取得了很大進展。新研制的TK/gE/gI三基因缺失苗有望成為候選疫苗株，多種新型抗病毒制劑的開發也成為該疫病緊急防控策略的重要組成部分。疫病檢測方面，我國學者研究出雙重液滴數字PCR (Duplex droplet digital PCR)與實時RPA檢測方法(Real-time RPA)，前者具有良好的線性和可重復性，靈敏度較實時熒光定量PCR高16倍[39]；后者快速簡便，在39 ℃下20 min即可完成PRV檢測[40]。兩種方法均有較高的準確性，且均能區分野毒株和gE缺失苗，為設定該疫病的防控策略提供了重要參考。然而，目前的形勢也越發嚴峻，PRV變異株在我國多個省市廣泛出現，毒力和傳播能力也較Bartha-K61株有所增強；此外生產中常出現PRV與豬瘟病毒、豬圓環病毒2型或大腸桿菌、副豬嗜血桿菌混合感染的情況。我國PRV的凈化之路仍然任重道遠！農業部在2017年3月的指導意見中，對偽狂犬病的防治提出了明確意見，要求我國所有國家核心種豬場必須在2020年前做到PRV陰性。及時遏止PRV的突變與傳播速度，不僅需要基礎病原學的快速發展，同樣也依賴于規模化豬場精準的防控措施和合理的免疫程序。相信在學界和業界的一致努力以及緊密合作，我國偽狂犬病的凈化道路一定會越走越穩。