牛蛙全身血管鑄型及骨骼透明標(biāo)本的制作

陳 鋒，吳鄒平，郭菁菁，呂婧薇，鄭宇彬，楊為祝，王思宇，李長征

(福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州350122)

鑄型透明標(biāo)本是往血管內(nèi)注入某種物質(zhì)，待硬化后將組織用物理和化學(xué)的方法使軟組織和透明劑的折光率相近，達(dá)到軟組織透明，使骨骼和鑄型枝被顯現(xiàn)[1]。此技術(shù)的運用可以為兩棲類動物血液循環(huán)的標(biāo)本制作提供直觀的全身血管形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，對兩棲類動物血液循環(huán)研究提供新的模型；對了解牛蛙全身血管和骨骼器官的分布情況，改進醫(yī)學(xué)動物試驗方法具有促進作用；在動物標(biāo)本制作方面為鼠、蛇和魚等其他小型動物鑄型透明標(biāo)本的制作提供新的思路；在標(biāo)本應(yīng)用方面為科研人員對于動物學(xué)的器官、骨骼和血管研究、比較解剖學(xué)的研究提供直觀的形態(tài)學(xué)依據(jù)。目前關(guān)于骨骼透明血管鑄型已有報道，但是基本多見于某個器官，小型動物全身標(biāo)本制作較少，難度較高[2-4]。本方法使用不同的透明方式，調(diào)整了填充劑濃度，提高了成功率，制作出的標(biāo)本效果良好，報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 來自福建地區(qū)健康成年的牛蛙10只，體重(0.25±0.05)kg，不分雌雄。15%過氯乙烯填充劑、無水乙醇、10%甲醛、尿素透明液(尿素240 g、10%甘油1 000 mL、Triton X-100 10 mL)、茜素紅、過氧化氫溶液、任氏液、20 mL塑料注射器、玻璃插管、止血鉗、持針器、鑷子、組織剪、燒杯、玻璃棒、量筒、玻璃缸若干等。

1.2 試驗方法 用鑷子夾取一浸透無水酒精的棉球,塞入牛蛙口腔中,待牛蛙全身肌肉松弛，眼瞼角膜反射消失；打開胸腹腔，剪開下腔靜脈放血，再打開心包，暴露心臟，剪開心室，在動脈干分叉處前插管結(jié)扎，然后用任氏液進行沖洗殘余血液與凝塊；將注射器上端連接在玻璃插管上，用力抽取直至不能抽動為止，然后用止血鉗夾住橡膠插管，以防空氣進入管道里面；向其注入配制好的15%過氯乙烯填充劑，見四肢末端有填充劑則停止灌注，每隔1～2 h補注1次，1～3次即可。

去除牛蛙皮膚，將其放入配好的10%甲醛固定(標(biāo)本體積5～10倍)，固定1周左右；固定后的標(biāo)本用流水沖洗5 h,過氧化氫漂白6～12 h(中途需更換)，清水沖洗6 h去除殘余過氧化氫，將標(biāo)本依次浸泡在配置好的80%、90%、100%酒精溶液中脫水各1周左右。

標(biāo)本放入尿素透明液中，半個月左右，見肌肉呈半透明狀態(tài)，骨骼隱約可見，即停止初步透明；預(yù)透明結(jié)束后，將標(biāo)本浸入0.01%茜素紅染液中2～3 d，見骨骼染上紫紅色為止；用水洗去表面浮色，將標(biāo)本浸入50%甘油溶液中，直到肌肉顏色褪為淡紅色為止，之后分別放入60%、70%、80%、90%甘油中各1周，待充分透明后浸入純甘油中保存。

2 結(jié)果

制作出的牛蛙標(biāo)本肌肉和軟組織呈淡黃色膠凍狀，全身血管清晰可見，骨骼完整且呈玫瑰紅色。所顯示的牛蛙頭骨、四肢骨和脊柱骨顏色清晰均勻，易于識別(見中插彩版圖1)；牛蛙頭部、脊柱區(qū)肩胛骨和四肢骨的血管(見中插彩版圖1和2)以及腹腔內(nèi)胃、腸的血管(見中插彩版圖3)清晰可見；從整體上能充分顯現(xiàn)骨骼系統(tǒng)和脈管系統(tǒng)在體內(nèi)的自然分布情況及毗鄰關(guān)系。

3 討論

試驗的注意事項：首先，本試驗中所選的牛蛙需滿足發(fā)育成熟、大小適中，太小不利于血管鑄型，太大不利于后期骨骼染色透明；其次，試驗過程中，牛蛙在失去生命體征后半個小時內(nèi)進行灌注最佳，若放置時間過長，易凝血，導(dǎo)致細(xì)小血管堵塞，影響灌注及透明效果；再次，灌注前需充分排血，用任氏液進行沖洗，可以保證蛙心的持續(xù)跳動；從次，血管灌注過程中，用力要均勻緩慢，若力度過大，管道內(nèi)壓力過大，易導(dǎo)致主動脈弓破裂使灌注失敗，因此需仔細(xì)感受壓力并時刻觀察牛蛙四肢及背部細(xì)小血管的灌注程度；最后，透明過程中需時刻保持警惕，否則將導(dǎo)致整個試驗失敗，如漂白時要注意觀察標(biāo)本的漂白程度，見肌肉上顏色基本脫掉即可，太過容易使細(xì)小鑄型枝褪色，肌肉間產(chǎn)生大量氣泡等問題。

試驗的改進創(chuàng)新：在透明劑的選擇上 以往的研究多選擇二甲苯和氫氧化鉀為透明劑，其中二甲苯透明效果顯著，但存在使組織收縮、變脆和硬化，影響透明效果等問題[5]，且二甲苯是一種強致癌物，對試驗者生命健康有潛在的威脅，氣體揮發(fā)到空氣中會對周圍環(huán)境造成污染；氫氧化鉀雖無毒無害，但在透明的時間和濃度上很難把握，很容易造成標(biāo)本的損壞且透明效果不穩(wěn)定；本試驗選擇無毒并具有一定溶解蛋白質(zhì)作用的尿素和細(xì)胞破膜劑Triton X-100[6]，兩者對組織的作用使甘油更易滲透，從而提高組織的透明度，透明后的組織呈膠凍狀，標(biāo)本形態(tài)完整，利于保存，且透明效果穩(wěn)定可靠，能極大提高透明標(biāo)本的成功率。

在填充劑濃度的選擇上,選擇過氯乙烯溶劑作為填充劑，其原理為溶劑揮發(fā)后凝固成型，此類填充劑收縮率大,流動性好,適合灌注流程較長的微細(xì)血管。以往的研究多集中于哺乳動物的血管灌注，多采用20%～25%過氯乙烯填充劑，以充分保證鑄型枝的飽滿。而牛蛙血管微細(xì)，其管徑、彈性和厚度都不如哺乳動物。因此，填充劑的濃度應(yīng)小于20%，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，選用濃度為15%過氯乙烯填充劑最為適宜。在該濃度下，灌注不會因管內(nèi)壓力過大而導(dǎo)致填充劑無法到達(dá)末端血管；也不會因填充劑濃度過低，揮發(fā)性過高，鑄型支無法完好顯現(xiàn)。

在試驗對象的選擇上 由于哺乳動物的體型相對較大，血管較粗、彈性較好、易于灌注，所以傳統(tǒng)上制作鑄型標(biāo)本時多采用哺乳動物作試驗對象，然而全身血管鑄型及骨骼透明標(biāo)本制作的報道僅見于胎兒，因哺乳動物胎兒期標(biāo)本的不易獲取，使其成為此類標(biāo)本制作鮮有報道的一個關(guān)鍵原因。而本次研究另辟蹊徑，選擇材料易找，難度大、技術(shù)要求高、成功率低的兩棲類動物-牛蛙作為對象，因其在全國各地的醫(yī)學(xué)院和動物科學(xué)院的動物試驗中應(yīng)用廣泛，有廣闊的市場應(yīng)用前景。

牛蛙全身動脈血管鑄型透明標(biāo)本的意義：(1)教學(xué)和科研方面 牛蛙作為兩棲恒溫動物，與人體在一定程度上有所相似，因而在眾多生物試驗上被選作試驗對象，然而在教學(xué)過程中，學(xué)生僅通過課堂講解和教學(xué)視頻來熟悉操作流程且無法直觀的了解牛蛙的解剖學(xué)構(gòu)造及重要臟器,在試驗過程中的盲目操作，導(dǎo)致判斷不出相應(yīng)的解剖部位，極易傷及血管，致使試驗失敗，從而達(dá)不到試驗預(yù)期效果。目前已有的教學(xué)實驗標(biāo)本-浸制標(biāo)本、骨骼標(biāo)本和剝制標(biāo)本等都存在著一定的不足，它們不但破壞了牛蛙的外形，而且不能很好的展示牛蛙血管和骨骼的位置關(guān)系。利用牛蛙全身動脈血管鑄型透明標(biāo)本，可以多維度的觀察血管的形態(tài)、走行以及血管與周圍肌肉、骨骼和器官的關(guān)系。在教學(xué)過程中，可以通過對標(biāo)本的觀察，讓學(xué)生有直觀立體的感性認(rèn)識，加深對牛蛙內(nèi)部器官結(jié)構(gòu)的印象，提高教學(xué)試驗的成功率，減少試驗的耗材。通過該標(biāo)本的制作也可以為科研人員對于動物學(xué)的器官、骨骼和血管研究、比較解剖學(xué)的研究、兩棲動物生理、生態(tài)的研究提供直觀的形態(tài)學(xué)依據(jù)。(2)養(yǎng)殖方面 隨著牛蛙養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，各種疾病問題相繼出現(xiàn)，對牛蛙養(yǎng)殖技術(shù)中疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提出了更高的要求。牛蛙全身血管鑄型透明標(biāo)本在牛蛙解剖的診斷治療中發(fā)揮了重要的指導(dǎo)作用。