唾液酸受體在大鼠腸黏膜微血管內皮細胞中的表達

唐玉玲，王昭華，霍彩云，郭曉桐，楊光輝，李穎鑫，王書揚，田海燕，胡艷欣

(中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193)

流感病毒屬于正粘病毒科，流感病毒屬，是有囊膜的單股負鏈RNA病毒。其中A型流感病毒感染可導致人類和動物嚴重的呼吸系統疾病，研究表明，高致病性A型流感病毒感染時，急性肺損傷并伴隨嚴重的炎癥反應是該病具有高死亡率的原因[1-2]。機體微循環系統遍布全身，微血管內皮細胞在微循環系統中起著最主要的保護作用，其中腸黏膜微血管內皮細胞在腸道中廣泛分布，其是否可作為A型流感病毒感染的靶細胞，并借此經胃腸道進行感染，這些問題值得我們深入探究。本試驗選取大鼠腸黏膜微血管內皮細胞，應用免疫熒光染色方法定性檢測SAα2，3Gal和SAα2，6Gal受體的表達情況，并利用流式細胞術對兩種受體進行定量分析，為進一步了解流感病毒能否經胃腸道感染的研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 細胞系 大鼠腸黏膜微血管內皮細胞(RIM-MVECs)，由北京農學院獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室惠贈。

1.2 主要試劑 多聚賴氨酸包被液：北京索萊寶科技有限公司產品；Triton X-100： Sigma-Aldrich 產品；濃硫酸：北京化工廠產品；PBS(磷酸鹽緩沖液，pH值7.4)：北京邁晨科技有限公司產品；熒光素標記植物凝集素：Vector Laboratories產品；BSA：北京索萊寶科技有限公司產品；4%中性甲醛：北京化學劑廠產品；中性樹膠：無錫江原實業技貿有限公司產品；DAPI： Roche產品；抗熒光淬滅劑：北京索萊寶科技有限公司產品。

1.3 大鼠腸黏膜微血管內皮細胞的培養 培養皿內加入10 mL含20%FBS的DMEM培養液，將細胞懸液吸出加入培養皿中，輕晃混勻復蘇細胞。置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養，6 h后更換新鮮的DMEM培養液。觀察培養皿中細胞的形態和密度，待細胞生長良好，密度約為90%時進行傳代。

1.4 細胞爬片的制備 蓋玻片用濃硫酸和無水乙醇分別浸泡處理后進行高壓蒸汽滅菌，處理后的細胞爬片置于多聚賴氨酸工作液中浸泡，室溫孵育10 min后取出，打開超凈臺紫外燈進行滅菌，展開晾干。0.25%胰蛋白酶消化細胞后，加入含20%FBS的DMEM培養液充分吹打，使之形成單細胞懸液。將處理好的細胞爬片放進24孔細胞培養板中，根據需要的細胞密度接種單細胞懸液，每孔加入500 μL單細胞懸液。將培養板置于5%CO2、37 ℃細胞培養箱中培養。

1.5 激光共聚焦定性檢測細胞表面唾液酸受體 去除陳舊的細胞培養基，經固定、透化、封閉后，直接加入帶熒光標記的抗體即熒光素標記的植物凝集素：FITC-MAA、FITC-SNA，室溫下孵育2～6 h。用DAPI染核，中性樹膠封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 流式細胞術定量檢測細胞表面唾液酸受體 0.25%胰蛋白酶消化細胞后，加入1 mL DMEM轉移至1.5 mL離心管中，1 000 r/min(4 ℃)離心5 min。棄上清后加入1mL流式緩沖液漂洗1次，1 000 r/min(4 ℃)離心5 min。避光條件下，在離心管中加入200 μL稀釋好的、帶熒光標記的植物凝集素FITC-MAA或FITC-SNA，重懸細胞，4 ℃條件下避光孵育1 h。離心管中加入1 mL流式緩沖液漂洗細胞1次，1 000 r/min(4 ℃)離心5 min，去上清。加入200 μL流式緩沖液，重懸細胞，流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 大鼠腸黏膜微血管內皮細胞表面唾液酸受體的定性檢測 大鼠腸黏膜微血管內皮細胞的免疫熒光染色結果，如中插彩版圖1所示，SNA-FITC、MAA-FITC染色后均呈陽性(綠色)，肉眼觀察SNA-FITC染色強度略高于MAA-FITC的染色強度。說明細胞表面既表達SAα2,6Gal又表達SAα2,3Gal，即同時表達人流感病毒受體和禽流感病毒受體，且受體表達量可能有所差異。

2.2 大鼠腸黏膜微血管內皮細胞表面唾液酸受體的定量檢測 為了進一步定量分析大鼠腸黏膜微血管內皮細胞表面唾液酸受體的表達情況，按照本文1.6所示方法，分別用濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的SNA-FITC或MAA-FITC孵育細胞，然后通過流式細胞儀進行定量分析。結果如中插彩版圖2所示，當濃度為5 μg/mL時，MAA-FITC(SAα2,3Gal)染色陽性細胞占70.5%，SNA-FITC(SAα2,6Gal)染色陽性細胞占98%；當使用更高濃度(10 μg/mL和20 μg/mL)進行孵育時，MAA-FITC和SNA-FITC染色陽性細胞均高于95%。平均熒光強度(Mean fluorescence intensity, MFI)隨著使用植物凝集素濃度的提高而提高，存在一定的濃度依賴性，當濃度為5 μg/mL時，SNA-FITC的平均熒光強度為MAA-FITC的9.49倍，濃度為10 μg/mL 時為11.83倍，濃度為20 μg/mL時為12.14倍。上述結果與我們在激光共聚焦中肉眼觀察到的結果一致，即SNA-FITC染色強度高于MAA-FITC，說明大鼠腸黏膜微血管內皮細胞表面SAa2,6Gal表達量高于SAa2,3Gal 的表達量。

3 討論

現階段科學研究表明，流感病毒感染宿主細胞的第一步是流感病毒表面的抗原決定簇血凝素蛋白與宿主細胞表面的唾液酸受體結合[3]。流感病毒的受體主要分為兩種：唾液酸α2,3半乳糖受體，其廣泛存在于人類的下呼吸道及禽類胃腸道，被認為主要被禽流感病毒識別；唾液酸α2,6半乳糖受體，被認為主要被人流感病毒識別[4]。唾液酸受體的種類和分布對于流感病毒的宿主范圍和發病機制的研究至關重要[5]。A型流感病毒通常是通過呼吸道感染哺乳動物，然而有相關報道，通過消化道感染流感病毒時見發生[6]。本試驗以大鼠的腸黏膜微血管內皮細胞為模型，證明了腸道細胞表面含有唾液酸受體，且SAa2,6Gal含量高于SAa2,3Gal 含量，提示腸道細胞可能更易感染人流感病毒。

微血管內皮細胞是位于循環血液與組織液之間的單層扁平上皮細胞，不但構成微血管通透性的物理屏障，而且作為一種多功能分泌細胞，能夠合成和釋放多種細胞因子，通過多種途徑參與調解機體免疫反應。微血管內皮細胞意義重大，在維持血管壁的完整性、調節血管張力、血小板活化和聚集及血管壁重塑等方面具有重要作用[7]。微血管內皮細胞的完整性被破壞，勢必會引起機體分泌功能失調，從而引發多種病理過程[8-9]。

有研究表明，高致病性禽流感病毒H5N1可通過腸道感染哺乳動物，病毒通過血管系統的全身傳播導致的廣泛性出血與內皮細胞和淋巴內皮細胞的大量感染有關[6]，這類似于禽類感染高致病性禽流感病毒的發病機制。而經呼吸道感染引起的全身性疾病的發病機制則正相反，病灶主要以壞死和炎癥為特征，與實質細胞而非內皮細胞中存在的流感病毒抗原有關。病毒從腸道進入后明顯的內皮趨向性提示高致病性H5N1流感病毒的表型具有高可塑性，哺乳動物系統性流感病毒感染的發病機制可能因侵染的入口不同而有差異。本試驗結果也為流感病毒的內皮細胞趨向性提供了基礎數據支持。內皮細胞在流感病毒感染中可能起著至關重要的作用，或存在重要的感染機制，本試驗的結果可為深入探究流感病毒通過腸道屏障經腸上皮細胞或通過血管系統經血管內皮細胞等不同途徑的傳播機制提供基礎數據。