呼吸道感染牛分枝桿菌對肝臟和腸道影響的病理組織學觀察

王振玲,李淼煊,孫 欣,程廣宇,劉春法,岳瑞超,王 杰,廖 軼,周向梅

(1.北京農業職業學院,北京 房山 102445;2.中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193)

結核病(TB)是一種起源很早的可共同感染人與動物的慢性傳染性疾病。在19世紀終期才被Robert Koch證實為細菌性疾病,至此人們才開始進一步研究和了解該病,其多為結核分枝桿菌復合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)引起。據世界衛生組織(WHO)提供的信息,僅在2016年就有170萬人死于結核病(四分之一感染有艾滋病病毒),其中只有近5%死亡發生在高等收入國家。我國結核病新發病例數位于印度和印度尼西亞之后,是危害我國公共健康的重大傳染病之一。

結核分枝桿菌復合群根據基因組多樣性和宿主傾向性,分為結核分支桿菌(M.tuberculosis)、牛分枝桿菌(M.bovis)、非洲分支桿菌(M.africanum)、Caprae分支桿菌(M.caprae)等。前兩種分支桿菌是對全球影響最大的病原體,宿主范圍極廣,可在人、寵物、家畜以及野生動物之間相互傳播。2012年Kira E.F.Ramdas[1]等人發現貓的肺中出現結核病變,而其主人患有結核病。該病的傳播途徑多種多樣,可通過分泌的乳汁、排出的尿液、糞便、膿液和痰、以及呼出的氣體,污染食物、墊料等經呼吸道、消化道進入機體,即直接接觸傳播或者接觸患病動物的呼氣和排泄物傳播[2]。

近10年由于我國牛奶和牛肉市場需求增大,奶牛養殖行業飛速發展呈規模化、集約化,牛結核病發病率出現逐步攀升的勢頭,陽性率甚至高達9%[3]。據估計,上個世紀前葉,牛結核病造成的家畜損失高于其他傳染病的總和,對于整個養殖行業的經濟有著嚴重的影響。同時,人們可以通過飲用未殺菌的牛奶或未加工的生牛肉感染結核病[3],其威脅著我國十幾億人口的健康,因此,研究和防治牛結核病迫在眉睫。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 本試驗所用牛分枝桿菌致弱株由中國農業大學國家動物海綿狀腦病實驗室保存。

1.2 實驗動物 于某牛場購買3～6月齡的犢牛,用PPD和IFN-γ釋放試驗檢測為結核病雙陰性,隔離飼養于圈舍。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌懸液的制備 在7H9液體培養基中接種細菌,培養于恒溫37℃的搖床中。培養6～8周后,倍比稀釋菌液并接種于7H10固體培養基中,然后開始菌落形成單位(CFU)計數,將細菌數量為1×103CFU的菌液置于-80℃冰箱中保存待用。

1.3.2 動物的分組及接種方法 將6頭犢牛分為對照組和試驗組,每組各3頭,做標記。選用滴鼻吸入接種的方法,用5 mL注射器吸取菌液2 mL,試驗組犢牛每頭每側鼻孔注入1 mL,感染劑量為2×103CFU。

1.3.3 病理組織學觀察 將兩組犢牛有病變或疑似有病變的部位(心、肝、脾、肺、腎、淋巴結、胃、腸等器官)切取下來,固定于10%福爾馬林。樣本固定后經常規組織處理,石蠟包埋,2～4 μm切片,采用H.E.染色,放于光學顯微鏡下觀察,采集圖像并記錄觀察結果。

2 試驗結果與分析

2.1 病理組織學觀察

2.1.1 肝臟 低倍鏡可見肝小葉中肝細胞索排列紊亂,肝細胞腫脹,中央區域肝竇消失(見中插彩版圖1A)。可見肉芽腫形成初期,大量炎性細胞浸潤,有的聚集形成嗜堿性深染的炎性灶(見中插彩版圖1B)。還見到粉色均質物質中心為部分藍染鈣化的干酪樣壞死,外周有炎性細胞浸潤,其中含有馬蹄形或圓形多核巨細胞(見中插彩版圖1C)。

高倍鏡可見肝細胞腫脹呈多角形,胞核偏向一側,細胞質減少呈弱嗜酸性,胞間界限不明顯。肝血竇中充滿紅細胞,部分可見狄氏隙(見中插彩版圖2A)。浸潤的炎性細胞有的胞核圓且嗜堿性深染,胞質極少為淋巴樣細胞,有的細胞核呈分葉或桿狀,胞質嗜酸性染色,為嗜中性粒細胞。肉芽腫早期的炎性灶區域的細胞呈兩端尖中間圓的梭型,胞質減少呈淺粉色,胞核大而空亮,出現上皮樣細胞增生和纖維化(見中插彩版圖2B)。鈣化中心周圍肝細胞壞死形成一片均質紅染無結構的團塊樣物質,偶見嗜堿性深染的崩解的細胞核碎片,外緣有數個細胞核排列在細胞周邊圍成馬蹄或圓形的多核巨細胞,胞漿豐富呈淺粉色(見中插彩版圖2C)。

2.1.2 腸道 低倍鏡可見十二指腸部分黏膜層上皮脫落,中央乳糜管周圍有炎性細胞聚集浸潤,局部有出血現象,十二指腸腺腺管偶見擴張含有均質粉染的分泌物,腺上皮細胞呈扁平狀(見中插彩版圖3A)。空腸固有層增厚,出現輕度增生,黏膜下層的結締組織疏松水腫(見中插彩版圖3B)。盲腸有輕度充血,固有層與腸絨毛脫離,結締組織疏松水腫并伴有炎性細胞聚集形成炎性灶(見中插彩版圖3C)。

高倍鏡可觀察到十二指腸炎性細胞主要是淋巴樣細胞,細胞核呈圓形、藍染,胞漿較少,其次是嗜中性粒細胞,胞漿飽滿嗜酸性染色,含有分葉狀細胞核。固有層中含有黃褐色的含鐵血黃素,有出血(見中插彩版圖4A)。空腸李氏隱窩間的結締組織疏松、水腫(見中插彩版圖4B)。

十二指腸偶見炎性細胞聚集,主要是淋巴細胞和嗜中性粒細胞,毛細血管充血。盲腸腸腺的潘氏細胞數量增多,可觀察到圓而深染嗜堿性且幾乎無細胞質的淋巴樣細胞和細胞核為分葉狀的嗜中性粒細胞(見中插彩版圖4C)。

3 討論

本試驗采用滴鼻吸入的方式,采集消化系統中肝臟和腸道,觀察牛分支桿菌對肝和腸道的影響。病理組織學觀察中發現肝臟出現典型肉芽腫結節,中心為鈣化中心,包裹于壞死組織中,外周炎性細胞浸潤并含有多核巨噬細胞,還發現小葉間的結締組織疏松水腫并增生,小葉尤其是中央靜脈周圍出現淋巴樣細胞炎性灶,這與程廣宇[4]、壬大孝[5]等人的文獻一致。在之前的文獻報道中,鮮有報道牛分枝桿菌對于腸道的影響,本文的結果發現,其對消化道的損傷沒有形成明顯的肉芽腫,僅有多個聚集的炎性灶,結締組織的增生等。Domingo M.[6]等人的研究顯示,臟器出現可觀察到的或典型結核病變通常與病畜的感染途徑有關,如果通過飲食,經消化道感染,則可能在感染動物的腸系膜淋巴結中造成損傷,但很少或幾乎不會在腸壁上看到損傷。腸道的結核主要見于人結核分支桿菌對于人回盲部的影響,分為潰瘍型、增生型和混合型。本研究使用牛分枝桿菌通過鼻腔吸入的方式觀察肝臟和腸道的損傷,因未進行牛分枝桿菌的分離培養或者標志性檢測確診,這種肉芽腫是否是結核特異型還是普通的炎癥反應還需要進一步證實。

經牛分枝桿菌感染部位,引發細胞和體液免疫,聚集大量的免疫細胞包括巨噬細胞、T細胞、樹突狀細胞。曾經人們一度以為肉芽腫可以抑制結核菌的生長增殖,然而隨著研究深入,大家的看法有些改變。牛分支桿菌的免疫反應缺陷和躲避免疫的毒性機制可使其被巨噬細胞吞噬,存活于其中并繁殖,形成潛伏性感染[7]。當自身抵抗力變弱時,分支桿菌會再次增殖。巨噬細胞在肉芽腫形成的早期,主要為M1型極化,促進肉芽腫的形成并保護宿主,然而在以后的過程中逐步向M2型極化轉變,結核肉芽腫所在微環境炎癥狀態也有微妙變化,使得肉芽腫保護宿主的作用減小。這種極化的改變對于結核分支桿菌的潛伏感染起到正向作用,提高宿主的敏感性和發病率[8]。總之,宿主感染牛結核分支桿菌后自身的免疫反應呈雙面性,一方面保護宿主形成肉芽腫,限制病原體擴散,另一方面該菌通過自身躲避機制,利用宿主的免疫細胞進行生長增殖。