魏氏梭菌外毒素引起細胞死亡的作用機制

許崇利,許崇波

（1.重慶醫藥高等專科學校醫學技術學院，重慶401331；2.韶關學院英東生命科學學院，廣東韶關512005）

魏氏梭菌是普遍存在于土壤、腐敗有機物和許多動物腸道中的一種革蘭氏陽性厭氧菌，其產生的高抵抗力內生孢子使其能在土壤等環境中持久存在[1－3]。魏氏梭菌產生大量毒素使其成為人類和動物非常嚴重的病原體，導致組織毒性、腸炎和腸毒血癥等疾病[4－5]。根據產生的毒素類型分為A、B、C、D和E型，最近F和 G型被歸為新的菌型，F型產生腸毒素，但其不產生β毒素、ε毒素、ι毒素而G型主要產生壞死性腸炎毒素B[6－7]。魏氏梭菌毒素蛋白通過識別靶細胞膜上相應受體從而激活細胞內信號途徑導致細胞病變最終引起細胞死亡[8－9]。近年對病原體誘導的宿主細胞死亡的研究揭示出這種過程涉及到各種復雜機制，而以前則認為其只是簡單的偶然過程。除了壞死和細胞凋亡兩種經典的細胞死亡途徑外，目前廣為所知的是許多病原體也可以觸發相應的途徑導致細胞死亡，包括細胞程序性壞死、自噬、細胞焦亡和細胞凋亡等途徑。掌握病原體殺死宿主細胞的作用機制和相關因子對于破譯細菌發病機制至關重要，是探索新型治療方法的關鍵途徑。

1 α毒素

1.1 α毒素遺傳學特性和結構特征 所有魏氏梭菌型均產生α毒素，其由370個氨基酸組成的鋅離子多功能金屬酶，在有鈣離子存在的情況下結合到宿主細胞的細胞膜上。α毒素包括N端催化結構域和C端結合結構域，另外還包括一個含有神經節苷脂結合位點的中心環結構域[8]。α毒素具有致死性，溶血性和皮膚壞死性，是人類氣性壞疽最重要的毒力因子，其主要特征表現為骨骼肌壞死，皮下水腫和肺氣腫，休克，多器官衰竭和死亡，此外在氣性壞疽中觀察到膽固醇依賴性溶細胞素的家族成員產氣莢膜梭菌溶素O與α毒素協同作用從而導致病理效應[10]。然而產氣莢膜梭菌溶素O在疾病中的所起的作用似乎很小，雖然A型魏氏梭菌與動物氣性壞疽有關，但α毒素作用機制尚未完全闡釋清楚。α毒素的活性非常復雜，因質膜中磷脂酰膽堿（PC）與鞘磷脂（SM）的比例等諸多因素的影響而產生變化，而且還受到局部毒素濃度的影響。因此許多α毒素作用途徑受這些因素影響。α毒素水解細胞膜中的磷脂酰膽堿與鞘磷脂產生二酰甘油和神經酰胺。除了這些活性，α毒素還可通過與Gi型GTP結合蛋白的相互作用間接激活與磷脂酶和鞘磷脂酶類似的內源性宿主酶[11]。然而α毒素的作用不僅局限于裂解細胞膜，其含有神經節苷脂結合位點的中心環結構域還可促進細胞膜上的原肌球蛋白受體激酶A的相互作用和聯結，從而激活MEK/ERK途徑[12]。有趣的是，缺乏神經節苷脂的DonQ或GM95細胞對α毒素作用高度敏感。神經節苷脂是糖鞘脂，可降低細胞膜的流動性，導致磷脂更緊密堆積在一起，并且還與影響底物利用率的靜電變化有關。這些作用可能會干擾α毒素的膜破壞活性，從而保護細胞免受細胞損傷。唾液酸對于神經節苷脂的結構非常重要，如果用唾液酸酶除去唾液酸則可增加細胞對α毒素的敏感性，這意味著α毒素和唾液酸酶之間存在潛在的協同作用。唾液酸酶的這種協同作用也可以增加其他魏氏梭菌毒素如 β毒素、ε毒素和腸毒素的結合活性。

如前所述，α毒素與細胞膜結合并作用于磷脂酰膽堿與鞘磷脂，除了激活Gi－GTP－BP信號途徑，還根據細胞類型觸發不同的信號途徑。如馬紅細胞由于α毒素的磷脂酶水解膜上的磷脂酰膽堿而裂解，也可能是由于內源性的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C活化而裂解，而α毒素對于含有微量磷脂酰膽堿的綿羊紅細胞的影響主要通過激活GTPBPs途徑的鞘磷脂代謝。在兔中性白細胞和DonQ細胞中，α毒素誘導的超氧陰離子的產生主要通過內源性磷脂酶C的活化和經由TrkA受體的PI3K磷酸化，以及 PDK1、PKCθ、MEK1/2、ERK1/2 系統和NF－κB的磷酸化[13]。除了激活穩定 IL－8 mRNA的p38MAPK途徑外，該途徑對A549細胞產生IL－8也很重要。另外氣性壞疽感染組織中的中性粒細胞缺乏及其在血管內皮上的積累可能是由于升高的IL－8促使中性粒細胞緊密粘附于細胞外基質蛋白而產生的影響。最近的研究還報道了由α毒素誘導的外周血中性粒細胞的分化和補充受損主要歸因于這些細胞中含有GM1a的脂筏的改變。此外，氣性壞疽期間厭氧微環境的持續性被認為是α毒素誘導的花生四烯酸代謝活化的結果，該過程由與炎癥、肌肉收縮、血小板聚集和血管收縮密切相關的磷脂酶A2、產生前列腺素、血栓和白細胞三烯來完成，從而最終導致灌注減少[14]。

1.2 α毒素引起細胞死亡的作用機制 α毒素溶解濃聚物可導致細胞膜的降解和乳酸脫氫酶大量釋放，這是壞死的典型特征。亞溶解濃聚物的α毒素能激活MEK/ERK信號途徑并產生活性氧（ROS），一定數量的活性氧可導致細胞氧化應激并啟動內在的細胞凋亡。最近的一項研究表明在GM95細胞中，低劑量α毒素誘導的鞘磷脂代謝與促凋亡介質如神經酰胺、N－乙酰乙醇胺和飽和脂肪酸的產生，以及線粒體細胞色素 C的釋放，細胞凋亡蛋白酶3的激活以及磷脂酰絲氨酸的增加有關。之前的研究表明神經酰胺在細胞凋亡中充當第二信使的作用，神經酰胺被加工成鞘氨醇，其在胞內的蓄積可導致溶酶體破裂最終釋放出大量的參與細胞凋亡的溶酶體酶。當α毒素被含膽固醇的細胞質膜微囊吞噬時形成胞內體并激活相應的信號通路，產生的活性氧導致溶酶體的損傷。另外胞漿內高水平的Ca2＋在細胞凋亡和壞死中扮演著關鍵的角色。α毒素促使1－磷酸－鞘氨醇和三磷酸肌醇的形成，二者都與胞漿內Ca2＋的運輸和蓄積有關[15]。然而到目前為止，胞漿內Ca2＋作為與α毒素相關的特定細胞死亡途徑的觸發器角色仍然沒有被詳細研究。

2 β毒素

2.1 β毒素遺傳學特性和結構特征 大毒力質粒攜帶β毒素基因cpb，該質粒也含有其他的毒素基因cpe和tpeL。β毒素是由336個氨基酸組成的強毒素，期中27個氨基酸的信號序列在分泌后被去除從而形成35 kD的成熟肽。推測的β毒素氨基酸序列與與金黃色葡萄球菌的δ毒素和β穿孔毒素具有顯著的同源性。β毒素被歸分類為α－溶血素家族中的梭狀芽孢桿菌β穿孔毒素，其對胰蛋白酶和其他蛋白酶極為敏感。由于對胰蛋白酶的敏感性，在體內外β毒素只在胰蛋白酶抑制劑存在時才有活性。變種的β毒素可能擁有不同的胰蛋白酶敏感性和體外細胞毒性。β毒素由B型和C型魏氏梭菌產生并且是人和動物幾種疾病主要的致病因素。B型魏氏梭菌產生的β毒素可引起綿羊致命性出血性痢疾，而C型魏氏梭菌分泌的β毒素則可引起幾種動物的壞死性腸炎和腸毒血癥及人類的壞死性腸炎。使用等基因無效突變體技術研究表明，β毒素可以重現兔小腸環中C型魏氏梭菌的病理學特征，同時也是山羊C型魏氏梭菌疾病的主要的毒力因子[16]。另外β毒素也是鼠腸毒血癥模型中主要的致死因素[17]。

與β毒素相關疾病的病理學特征主要表現為小腸和大腸上皮細胞出血和壞死。β毒素引起的損傷始于腸粘膜但可發展到腸的所有層。阻塞粘膜固有層中存在的超級微血管的纖維蛋白血栓是與β毒素相關的腸道疾病的主要特征。粘膜上皮是毒素誘導損傷的主要目標還是繼發于血管血栓形成一直是爭論焦點。在兔腸環模型中，接種野生型魏氏梭菌C型分離株CN3685在血栓形成明顯之前產生絨毛尖端壞死，意味著早期腸上皮細胞損傷。另一方面，在仔豬和人類患者的壞死性腸炎病例以及早期血管病變的豬感染模型中的粘膜固有層上皮細胞中均通過免疫組織化學技術證實β毒素的作用。然而，在所有這些研究中，已經出現的組織壞死并未檢測到β毒素與上皮細胞的結合，對豬空腸外植體β毒素免疫組織化學的進一步研究表明毒素與上皮細胞并沒有結合，而且完整上皮細胞層的存在抑制腸內層β毒素的測定[18]。同樣的研究顯示，與重組β毒素共培養時，豬腸上皮細胞和原代空腸上皮細胞均沒有出現細胞病變效應。在豬腸道模型中曾提出上皮細胞的最初損傷是源于β毒素到達粘膜固有層的微血管。但是，因為抗β毒素抗體并沒有阻止兩株C型魏氏梭菌菌株上清誘導的豬腸上皮細胞的損傷，從而可以推斷β毒素并不是細胞病變效應的主要因素[18]。此外，觀察到β毒素在小鼠皮膚中的間接血管作用，毒素能夠誘導物質P（一種來自感覺神經元的NK1激動劑）的釋放，最終導致TNF－α和血漿外滲物的釋放[19]。

作為寡聚體的穿孔毒素β毒素可在易感細胞的細胞膜上形成功能性孔道。通過這些孔道K＋流出胞外，Ca2＋、Na＋和 Cl－流入胞內，同時細胞發生膨脹。β毒素誘導的鉀離子流出促進p38 MAP和JNK激酶的磷酸化，從而激活與宿主細胞存活和適應相關的途徑。已經在不同的人造血腫瘤細胞系中測試了細胞對β毒素作用的易感性，與HL－60、BALL－1和MOLT－4相比，THP－1和U937細胞顯示出最高的β毒素誘導的細胞毒性。使用原代豬主動脈內皮細胞，結果證明β毒素可誘導肌動蛋白細胞骨架的快速裂解、細胞邊緣回縮和細胞皺縮。細胞易感性的差異清楚地表明毒素與特異性受體結合。最近研究表明β毒素可能與ATP門控的P2X7受體結合，之后ATP通過稱為Pannexin 1的ATP通道從細胞中釋放出來。與β毒素結合相關的ATP釋放的方式尚不清楚；然而，它與細胞裂解無關。也許，通過β毒素CPB孔道的Ca2＋的初始流入能誘導線粒體ATP產生并且隨后從受影響的細胞中釋放出去。據推測，通過Panx1通道ATP從細胞釋放并迅速達到峰值可刺激β毒素寡聚體的進一步形成，從而導致細胞毒性。Panx1與結合β毒素的P2X7受體相互作用將影響Panx1通道開放并促進ATP釋放[20]。腸細胞和內皮細胞均表達P2X7受體和Panx1，但它們在體內與β毒素有關疾病中的作用需要進一步研究。

2.2 β毒素引起細胞死亡的作用機制 使用豬內皮細胞的研究表明，重組β毒素能迅速誘導與壞死一致的特征，包括LDH釋放和碘化丙啶的攝入。二者都可被鈣蛋白酶抑制劑和necrostatin－1（受體相互作用蛋白激酶1抑制劑）所抑制，這表明β毒素誘導的壞死性細胞死亡不是被動事件，而是通過程序化的生化途徑完成的。研究人員推斷necrostatin效應表明β毒素誘導細胞程序性壞死。然而值得一提的是necrostain的作用靶標受體相互作用蛋白激酶1也可能參與細胞凋亡過程[21]。另一方面，研究同時檢測到低水平的細胞凋亡蛋白酶－3活化，但沒有明顯的DNA片段化，這表明在毒素濃度和孵育時間的條件下，細胞凋亡不是重要的細胞死亡途徑。細胞凋亡蛋白酶－3在這些細胞中是怎樣被活化的并沒有進一步研究，也許可以假設胞漿中鈣離子上升可能起到關鍵作用，因為其通過活化鈣激酶從而與細胞凋亡和細胞程序性壞死密切相關[22]。

3 ε毒素

3.1 ε毒素遺傳學特性和結構特征 ε毒素基因etx與其他毒素基因cpb2和cpe都位于質粒上，ε毒素先以無活性的前體形式分泌，分子量約為33 kD，隨后被宿主產生的腸蛋白酶所激活，這些酶主要有胰蛋白酶、α－糜蛋白酶、羧肽酶類和λ－蛋白酶。利用胰蛋白酶、α－糜蛋白酶去除ε毒素前體N末端13個氨基酸殘基和C末端29個氨基酸殘基使其成為成熟的ε毒素，毒性是其前體的1000倍。魏氏梭菌λ－蛋白酶僅去除N－末端10個氨基酸殘基。在使用山羊腸內容物的離體研究中，ε毒素前體通過SDS－PAGE逐步形成約為27 kD的穩定條帶。該條帶含有三種不同C末端的ε毒素且每種都具有細胞毒性。這種ε毒素C末端序列的加工顯然是由腸羧肽酶來完成的。上述研究表明當僅使用純化的蛋白酶時，體內ε毒素活化比先前報道的更為復雜[23]。鑒于其與氣單胞菌產生的氣溶素結構相似性，ε毒素被歸類為氣溶素家族的七聚體β穿孔素，盡管它們之間沒有顯著的氨基酸序列相似性。ε毒素是繼肉毒菌毒素和破傷風毒素后已知的第三種最有效的梭菌毒素，由B型和D型魏氏梭菌合成。通過etx基因敲除的綿羊、山羊和小鼠模型研究證實ε毒素是D型魏氏梭菌引起的腸毒血癥的主要致病因子[24]。

ε毒素在腸道中產生，即使在羊腸毒血癥中可能存在纖維壞死性結腸炎情況下，其作用靶標主要是中樞神經系統、肺和心臟等器官。ε毒素通過增加腸通透性來促進其自身的吸收。這種效果尚未完全清楚，但它涉及粘膜緊密連接的斷裂和腸道固有層的退行性變化。在顯微鏡下，腦部病變往往是多灶性的，其特征是血管周圍和壁內血管水腫、出血，并且在多數慢性病例情況下，白質壞死和星形膠質細胞和軸突腫脹。后者通常是對稱的和雙邊的。這些病變的起源被認為是毒素與腦－血屏障的內皮細胞的初始結合的結果，因為在小鼠中靜脈內接種用綠色熒光蛋白標記的ε毒素顯示出毒素結合到這些細胞上[25]。與ε毒素結合后，內皮細胞變得腫脹，空泡化和壞死。通過破壞腦－血屏障，發生液體和蛋白質的滲漏，導致水腫，引起神經薄壁組織的機械損傷和缺氧。為了應對這種水腫，大鼠和綿羊的星形膠質細胞過表達水通道蛋白－4，這也許是宿主試圖從血管周圍空間減少多余的液體。除了對大腦的這種間接影響外，ε毒素還可直接影響某些神經元和少突膠質細胞，但不影響星形膠質細胞[26]。注射綠色熒光蛋白標記的ε毒素顯示出腎臟發生嚴重改變，包括遠端小管變性和髓質出血。使用來自不同物種的腎源的細胞系已經廣泛研究了ε毒素的結合特性和細胞毒活性，其中尚未報道狗、小鼠和人的D型腸毒血癥病例。ε毒素作用的起始步驟涉及與未知細胞表面受體結合并在膜表面形成一個七聚體的前孔，隨后插入到細胞膜以形成活性孔。最近的研究表明ε毒素激活中性鞘磷脂酶，其反過來通過在質膜中產生神經酰胺來促進寡聚體的形成。事實上，敲除中性鞘磷脂酶阻斷了ACHN細胞中的寡聚體形成和ε毒素誘導的細胞死亡。由于從魏氏梭菌培養物中分離的ε毒素可能含有α毒素雜質（其也可誘導神經酰胺的形成），由于α毒素也能產生這樣的效應，從而表明兩種毒素可以協同發揮作用，當然這種可能性尚未進行深入研究[27]。在體外，ε毒素與MDCK和ACHN細胞中的甲型肝炎病毒細胞受體相結合促進細胞毒性。然而，在對ε毒素具有抗性的細胞中誘導甲型肝炎病毒細胞受體表達并不會導致其對毒素的敏感性。已發現幾種細胞類型中的髓鞘質和淋巴細胞蛋白是ε毒素細胞毒性所必需的。髓鞘質和淋巴細胞蛋白是內皮細胞，腎細胞和少突神經膠質細胞等許多細胞的ε毒素靶標。髓鞘質和淋巴細胞蛋白也許是ε毒素特異性受體，其組裝成多蛋白復合體用于ε毒素與細胞膜相互作用，甚至本身具有一套獨立于孔形成的機制[28]。

3.2 ε毒素引起細胞死亡的作用機制 與ε毒素作用相關的細胞內途徑和細胞死亡的機制尚未完全被闡釋清楚。然而毒素誘導的細胞內變化與壞死特征相一致，如顯著的細胞腫脹、線粒體消失、起泡、膜破裂、ATP消耗、核皺縮、碘化丙啶攝取增加及無DNA片段化。受感染細胞形成孔導致胞內K＋的快速流失，Cl－和Na＋的流入，隨后是胞漿內Ca2＋的增加。這種細胞內電解質的不平衡盡管看起來很有可能參與激活特定的下游信號事件最終導致細胞死亡，但是迄今為止并沒有得到證實。受ε毒素影響的細胞失去了產生能量所需至關重要輔酶，特別是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和輔酶A，有助于線粒體膜電位的消散和線粒體通透性轉換孔的開放。與上述結果一致，AMP激活的蛋白激酶（ATP胞內感受器），在受ε毒素影響的細胞中受到影響。此外，凋亡誘導因子（一種有效的半胱天冬酶非依賴性細胞死亡因子）從線粒體轉移到細胞核。在體外用ε毒素處理的腎細胞中，大分子的細胞旁通透性沒有顯著增加，并且肌動蛋白細胞骨架和粘著連接的組織不受影響。在大腦中，ε毒素可與某些類型的神經元結合并導致膜電阻降低，這歸因于孔形成。這誘導了與胞漿中Ca2＋增加相關的膜去極化，隨后釋放出神經遞質谷氨酸。有趣的是，ε毒素不會在少突神經膠質細胞膜中形成孔道；因此，相關的谷氨酸釋放，通過不同機制發生的Ca2＋波動和脫髓鞘，如ε毒素和髓鞘質和淋巴細胞蛋白相互作用的胞內途徑。

4 ι毒素

4.1 ι毒素遺傳學特性和結構特征 ι毒素是由酶組分（Ia）和結合組分（Ib）組成的二元毒素。兩種成分均由兩個獨立的基因iap和iab編碼，兩個基因位于大的接合質粒上。Ib分子量為100 kD，合成初期無活性，胰蛋白酶或糜蛋白酶水解除去20 kD N－末端片段后變成有活性的蛋白體。ι毒素由E型魏氏梭菌菌株分泌。許多動物的腸道疾病均與該毒素有關。然而，大多數病例的診斷僅基于從出血性腸炎動物的腸內容物中分離出的E型魏氏梭菌，但是這并不是E型魏氏梭菌感染的診斷標準。此外科赫原則尚未完全應用于E型疾病，ι毒素在疾病中的具體作用仍不清楚。在過去，基于在被感染動物的腸中檢測到ι毒素，將兔腸毒血癥的歸因于E型魏氏梭菌的感染。然而，據推測，這些病例可能是由梭狀芽孢桿菌產生的類似ι的毒素引起的，通過目前可用的毒素檢測方法證實其與ι毒素交叉反應。到目前為止，還沒有可靠的診斷標準用于診斷與E型魏氏梭菌相關的腸道疾病已報道脂解激活脂蛋白受體（LSR）是Ib的細胞受體，其介導毒素進入宿主細胞。研究表明ι毒素進入宿主細胞涉及細胞表面抗原CD44相關的內吞作用[29]。一旦與受體結合，Ib組裝成七聚體并插入宿主細胞膜形成功能性通道，從而允許離子運輸以及Ia的易位和內吞作用。Ia酶組分也以無活性的形式分泌，需要蛋白水解除去N末端9至11個殘基才能成為成熟蛋白體。Ia的C－結構域負責毒素的ADP－核糖基化活性，其涉及肌動蛋白177位精氨酸殘基與ADP－核糖基化的供價連接，這導致肌動蛋白絲的解聚和G－肌動蛋白單體的增加。肌動蛋白細胞骨架的解聚導致細胞形態的變化和細胞間緊密和基底外側連接的解體，導致培養的腸細胞滲透性增加。兩種ι毒素組分都通過依賴ρ因子，網格蛋白非依賴性途徑內化于靶細胞中并到達內吞囊泡。一小部分Ib再循環回到細胞膜，使Ia的攝取進一步增強。內吞后Ia從晚期內體轉移到細胞質中，在那里發揮ADP－核糖基化活性，這種易位需要晚期內體具有酸性環境[30]。

4.2 ι毒素引起細胞死亡的作用機制 已有的研究證實Ib本身可以誘導細胞毒活性，特別是在兩種人細胞系A431（上皮癌）和 A549（肺腺癌）。這些細胞毒性作用涉及顯著的細胞腫脹，線粒體功能障礙，ATP消耗和IP攝入增加，所有特征均與壞死相一致。即使觀察到促凋亡分子Bax和Bak的活化以及細胞色素C釋放，但未檢測到細胞凋亡蛋白酶－3的活化，并且用泛半胱天冬酶抑制劑Z－VAD－FMK孵育細胞并不能保護細胞免受Ib誘導的細胞死亡。在該研究中，細胞存活需Ib的內吞，表明內吞作用在保護細胞免受與Ib相關的孔形成中扮演關鍵角色。而在另一項研究中，ι毒素處理Vero細胞在孵育12～15 h后誘導細胞凋亡蛋白酶－3活化。這種凋亡細胞死亡的延遲誘導歸因于ADP－核糖基化Ia靶向肌動蛋白的細胞溶質穩定性[31]。

5 腸毒素

5.1 腸毒素遺傳學特性和結構特征 cpe基因既可以位于染色體上也可以位于質粒上，并且毒素僅在孢子形成期間表達。腸毒素由319個氨基酸組成的單鏈多肽。腸毒素的C末端沒有細胞毒活性，但介導與受體的結合，其末端位于30個氨基酸中的酪氨酸殘基起著關鍵作用。另一方面腸毒素的N末端具有細胞毒性且對于腸毒素的寡聚化和膜孔的形成尤為重要。腸毒素是F型魏氏梭菌孢子形成時期產生的成孔毒素，但C型和D型魏氏梭菌也產生腸毒素，另外E型魏氏梭菌攜帶有沉默的cpe基因或產生腸毒素變種。實驗和流行病學證據表明腸毒素是與人類食物中毒相關的F型魏氏梭菌的主要毒力因子。在兔子中產生腸毒素的F型魏氏梭菌驗證了科赫原則且5%～10%抗生素相關性腹瀉與F型魏氏梭菌有關[32]。腸毒素引起的食物中毒主要癥狀包括腹瀉和腹部痙攣，并且通常在一兩天后自發消退。然而在便秘或糞便嵌塞等一些因素誘發下則成為致命性的。在上述條件下減少腹瀉影響，毒素會延長其與腸的接觸，促進吸收以及與腸外器官的作用。這種腸毒性作用在結扎小鼠的腸環中得到驗證，接種的腸毒素進入循環并引起高血鉀導致死亡。腸毒素的細胞受體屬于緊密連接蛋白家族（claudins）成員，位于上皮細胞和內皮細胞之間的頂端接觸區域。已經證實claudins 3、4、6、8和14 是腸毒素受體，腸毒素與 claudin受體的初始結合形成約90 kD的“小復合物”。幾種小復合物的相互作用導致腸毒素的寡聚化和細胞膜表面形成前孔，最終形成約450 kD的CH－1大復合物，包括六聚體的腸毒素，受體和非受體的claudins。腸毒素β發夾環組裝成β桶并迅速插入靶細胞膜從而啟動陽離子穿透孔的形成，鈣離子通過穿透孔注入細胞從而在腸毒素誘導的細胞死亡中起著關鍵作用[33]。

5.2 腸毒素引起細胞死亡的作用機制 當用低劑量腸毒素孵育Caco－2細胞時，形成少量的孔隨后鈣離子適度流入，導致鈣蛋白酶活化和凋亡，伴隨著細胞色素C釋放和細胞凋亡蛋白酶－3活化。然而隨著腸毒素劑量的增加，形成更多孔導致大量鈣離子的涌入和更強鈣蛋白酶活化，導致極小量的細胞凋亡蛋白酶－3活化和與壞死一致的細胞形態變化。延長體外孵育時間加劇了細胞形態變化，導致基底外側細胞表面外露，從而結合更多的腸毒素并形成約600 kD的更大的復合體CH－2，包括緊密連接蛋白和閉合蛋白[34]。在小鼠和兔子的小腸環中，腸毒素誘導的劑量依賴性組織學損傷表現為嚴重的絨毛縮短，脫屑以及和壞死特征相一致的上皮細胞變化。在兔結腸中也發生組織學損傷，與先前的體外發現相反，用腸毒素處理小鼠腸環能夠誘導劑量和時間依賴性的細胞凋亡蛋白－3的活化。然而這種激活對于腸道病變的發展并不是必需的，因為使用泛半胱天冬酶抑制劑Q－VD－OPh并不能防止腸道損傷或腸毒血癥死亡。目前為止尚未進一步探索鈣蛋白酶激活的作用和細胞程序性死亡在腸毒素相關疾病中的潛在作用。

6 壞死性腸炎毒素B

6.1 壞死性腸炎毒素B遺傳學特性和結構特征壞死性腸炎毒素B基因netB位于名為NELoc1的42 kb致病性基因座上，存在于大的接合質粒上。與β毒素一樣，壞死性腸炎毒素B與來自金黃色葡萄球菌的β－PFT（α溶血素）具有部分序列相似性。根據新近的毒素分型方案，壞死性腸炎毒素B由G型魏氏梭菌菌株產生。對于這種毒素的科赫法則已經在雞疾病模型中得到驗證，研究表明壞死性腸炎毒素B是導致禽類壞死性腸炎發展的主要毒力因子，這也得到了強有力的流行病學證據的支持。禽流感壞死性腸炎病例中腸細胞的死亡是由于粘膜固有層、細胞外基質和細胞間連接破壞引起的。壞死性腸炎毒素B形成中心直徑約為26的七聚體親水性孔。然而壞死性腸炎毒素B的特異性受體尚未被鑒定出來[35]。

6.2 壞死性腸炎毒素B引起細胞死亡的作用機制與其他成孔毒素相比，壞死性腸炎毒素B形成的孔允許Na＋、Cl－和Ca2＋的流入并導致滲透細胞的裂解，該毒素誘導LMH細胞的變圓和裂解，隨后釋放LDH，雖然這與壞死特征相一致，但其涉及的細胞死亡特定途徑及在腸道上的作用并沒有被深入研究[36]。

7 展 望

過去幾年對于魏氏梭菌毒素作用的分子機制進行諸多研究，但主要集中在少數物種，比如馬和綿羊為對象研究α毒素的溶血活性，在山羊中ε毒素誘發腸毒素癥作用機制。在研究魏氏梭菌感染的發病機理時，宿主和細胞易感性是需要考慮的關鍵因素，因此魏氏梭菌相關疾病的體外或動物模型的選擇應該解決這些變化。由于大多數魏氏梭菌毒素結合并作用于宿主細胞膜上的受體，因此發病早期是治療魏氏梭菌相關疾病的有效靶標。例如已顯示Mepacrine治療劑通過干擾孔形成和毒素插入來保護腸細胞樣細胞免于體外腸毒素作用。目前正在小鼠模型中研究Mepacrine對于腸毒素的潛在作用。大多數魏氏梭菌毒素作用的最終結果是細胞死亡。過去幾年通過使用不同的方法，在闡釋復雜的細胞內途徑方面取得了顯著進展。然而在這方面仍存在許多空白，剖析魏氏梭菌毒素和靶細胞之間的復雜相互作用可能會發現其他的藥理學靶標。筆者課題組一直從事魏氏梭菌外毒素研究工作，主要集中在對α和β毒素的基因克隆、表達及免疫原性方面的研究，利用定點突變技術不但使其生物學活性發生了改變，而且揭示了其二級和三級結構并且構建的α、β融合蛋白具有良好的免疫原性，從而為預防由魏氏梭菌引起的相關疾病提供了免疫效果良好的基因工程亞單位疫苗。