RNA結合基序蛋白20在心肌病中作用的研究進展

楊 珍，劉宇寧，余 薇,鄭 萍

(湖北科技學院1.藥學院、2.臨床醫學院，湖北 咸寧 437100)

近年來，由于人口的增長和老齡化，心臟疾病的發病率不斷升高，防治心臟疾病已經成為國家社會共同面對的巨大問題。全球每年死于心臟疾病人數約350萬人。心臟疾病是美國的十大死因之首[1]。心肌病是心臟疾病的一種，給社會和個人帶來了極大的健康威脅和經濟負擔，因此，尋找防治心肌病治療的靶點和途徑刻不容緩。現發現很多因素參與心肌病發生、發展，目前認為RNA結合基序蛋白20(RNA-binding motif protein 20，RBM 20)與心肌病密切相連。本文主要圍繞近年來RBM 20調控機制的研究進行綜述。

1 RBM 20的結構與功能

RBM 20由14個外顯子組成，編碼具有原型RNA識別基序1(RRM-1)的RNA結合基序蛋白20，在橫紋肌尤其是心肌中高度表達[2]。RBM 20蛋白含有其他剪接因子常見的典型結構域，包括富含脯氨酸、谷氨酸的結構域，原型核糖核酸識別基序(prototypical ribonucleic acid recognition motif，RRM)，富含精氨酸/絲氨酸的結構域(arginine/serine-rich domain，RS)和U1鋅指結構域。其中，RRM和RS是兩個高度保守的功能結構域，對于蛋白質的核保留是必需的[3]。日益認為RBM 20結構的變化與心臟疾病密切相關。RBM 20中鑒定出第1個突變涉及肌聯蛋白(Titin)的選擇性剪接。近幾年，陸續發現多種基因突變，突變熱點發生在RRM和RS結構域：V535I、R634Q、R634W、S635A、R636C、R636H、R636S、S637G、P638L，以及突變熱點外的富含谷氨酸結構域：E913K以及位于外顯子9的R716Q。RBM 20突變可能導致RBM 20蛋白錯誤折疊，并干擾其與目標RNA序列結合的能力，也可能干擾RBM 20的核定位[4-5]。

選擇性剪接在心臟適應性反應中起主要作用，剪接因子序列的改變或突變導致的基因產物的錯誤剪接，是多種人類遺傳疾病的根本原因。研究表明，RBM 20對RNA剪接體的形成和選擇性剪接起調控作用。剪接體是在剪接過程中從轉錄前體信使RNA(RNA precursors，pre-mRNAs)中去除內含子的核糖核蛋白復合物。RBM 20直接調節心臟依賴的RNA加工轉錄因子，影響下游基因的表達模式，從而導致心臟疾病[6]。RNA測序表明，RBM 20選擇性剪接與心肌病、離子穩態和肌節生物學密切相關的31個基因具有關聯性。最近的一項研究表明，在大鼠心臟組織中，有18個基因直接與RBM 20結合，并受RBM 20選擇性剪接，在這些基因中，RBM 20對Titin、鈣/鈣調蛋白調節激酶IIδ(Ca2+/calmodulin-dependent kinase Ⅱδ，CaMKⅡδ)、鈣離子通道基因CACNA1C、橫紋肌LIM域結合蛋白3(LIM-domain-binding protein 3，LDB 3)、阿諾堿受體2(ryanodine receptor 2，RyR 2)進行保守的差異剪接[7]。RBM 20的選擇性剪接功能與心肌病的發生、發展密切相關。

2 RBM 20與心肌病

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一種以左心室擴大和收縮功能降低為特征的常見病癥，具有高滲透性、侵襲性，不可避免地導致心力衰竭。2009年，人們首次發現，家族性DCM患者的RBM 20 RS結構域發生突變，因為RBM 20在心肌中高度表達，并且編碼調控前信使RNA的剪接體，因此認為其與人類心肌病密切相關[8]。現已發現，RBM 20是DCM中突變頻率最高的基因之一，RBM 20突變會導致DCM、進行性心力衰竭和猝死，在高達3%的特發性DCM患者、5%的確診或疑似家族性病例和超過13%的有心源性猝死病史的患者中，都發現了RBM 20突變。隨后的研究發現，RBM 20基因敲除的大鼠和具有RBM 20突變的人都患有心肌纖維化、心律失常和猝死，這說明RBM 20參與DCM的發生過程。動物實驗表明，RBM 20敲除會導致DCM。基因敲除大鼠生理表現為最大心輸出量降低，骨骼肌功能下降，左心室電鏡觀察到肌原纖維排列異常，脂褐素沉積[9]。此外，細胞水平上也驗證了RBM 20的功能。在RBM 20敲除的小鼠的心肌細胞中，RBM 20突變會導致Titin向更有彈性的亞型轉變，RBM 20缺陷導致肌節組織紊亂和肌漿網中離子轉運受損，最終導致DCM。多能干細胞中的RBM 20突變或RBM 20敲除重現了DCM患者的分子缺陷，與健康組相比，RBM 20突變多能干細胞組表現出α-輔肌動蛋白的異常分布、鈣處理紊亂以及N2B亞型的表達水平降低[10-11]。

心肌病的終末階段會發生心力衰竭，射血分數保留型心衰(heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF)是一種以心室充盈功能受損為特征的復雜臨床綜合征，左心室僵硬度增加是HFpEF的重要特征。左心室僵硬程度由細胞外基質(extracellular matrix，ECM)和心肌細胞調節，而Titin調控ECM和心肌細胞的被動剛度。實驗表明，通過調節RBM 20表達水平來調節Titin剪接，有利于心臟在心衰時保持射血分數。在Titin N2B亞型敲除小鼠中，RBM 20活性降低了50%，維持了心臟充盈舒張，改善了心臟萎縮，一定程度上恢復了與脂肪酸代謝以及橫紋肌發育相關的基因表達[12]。在RBM 20等位基因RRM敲除的小鼠模型心臟中，順應性的Titin亞型大量表達，于3周時達到最大表達量，舒張功能改善，最終導致左室順應性增加，改善了左心室僵硬程度[13]。

3 RBM 20作用的調控機制

3.1 RBM 20與Titin肌節是橫紋肌肌原纖維中最小的收縮單元，Titin是肌節中的第3類豐富蛋白，決定了橫紋肌的結構和彈性，與人類心臟病密切相關。Titin可在橫紋肌中產生數百萬種亞型，心臟Titin主要產生兩種主要亞型：短而僵硬的N2B亞型，以及更長、更有彈性的N2BA亞型[14]。根據發育階段和物種的不同，這兩種亞型之間的轉換提供可變的被動剛度，以滿足生理需求。心肌被動剛度的增加，可以防止舒張期間壓力增加而導致的心室過度充盈。研究發現，Titin亞型的轉變與心肌順應性的變化、心臟疾病的發生密切相關。在一些心臟疾病中，Titin亞型比值發生變化。在健康人的左心室中，N2BA與N2B亞型的表達比約為30 ∶70，在收縮性心力衰竭的心臟中發現N2BA與N2B的比例增加，而舒張性心力衰竭N2BA與N2B比例下降。在RBM 20缺失的大小鼠模型中，N2BA/N2B發生變化，并且開始轉換以更大分子質量的N2BA-G亞型存在，這說明RBM 20抑制Titin選擇性剪接[6]。

RBM 20通過調控Titin pre-mRNA的剪接，抑制Titin的表達。RBM 20與Titin pre-mRNA中含有UCUU的RNA元件結合，并抑制結合區域中內含子的去除，除RNA元件的剩余pre-mRNA將被剪接并保留在細胞核中，等待進一步處理[7]。在人和大鼠中，Titin的錯誤剪接廣泛存在，RBM 20缺乏時Titin表達增多。

RBM 20介導的Titin剪接是劑量依賴性的。在野生型大鼠心肌中，主要表達較小的N2B亞型；在RBM 20敲除雜合大鼠中，高表達中等大小的N2BA；在RBM 20敲除純合大鼠中，表達大亞型N2BA-G。此外，研究表明，胰島素和甲狀腺激素可以通過激活磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of repamycin，PI3K/Akt/mTOR)信號通路，增加RBM 20表達，進而Titin亞型發生改變，降低了N2BA/N2B的比值；相反，抑制PI3K或mTOR激酶，可明顯降低剪接因子RBM 20的蛋白表達[15-16]。

有趣的是，RBM 20在由Titin基因形成的環狀RNA(Circular RNA，CircRNA)的過程中起著重要作用。CircRNA是一種非編碼RNA分子，心臟中約26%與外顯子跳躍有關的CircRNA來源于Titin，Titin通過選擇性剪接產生CircRNA。研究表明，在RBM 20敲除心臟中，有38個差異表達的CircRNA，其中12個來自Titin基因。這說明RBM 20參與Titin基因形成的CircRNA，但是現有實驗表明，RBM 20并不是心臟CircRNA形成的整體調節因子。目前關于CircRNA的研究尚少，還需進一步探索[17]。

3.2 RBM 20與RyR 2阿諾堿受體參與心臟興奮-收縮偶聯的過程，是重要的Ca2+釋放通道，發揮維持細胞的興奮性的重要作用。RyR 2亞型主要在心肌和平滑肌細胞中表達。 RyR 2由4個單體組成，每個單體結合1個調節蛋白FK 506結合蛋白12.6 (FK 506 binding protein 12.6，FKBP 12.6)，FKBP 12.6和RyR 2結合，調節Ca2+釋放通道的開放[18]。

心肌RyR 2的激活和失活受鈣調素(calmodulin，CAM)、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、CAMKII調節，同時FKBP 12、FKBP 12.6等也參與RyR2的調控。在CAM存在下，Ca2+激活PKA后，PKA磷酸化RyR 2，磷酸化的RyR 2與調節蛋白FKBP 12.6解離，鈣離子通道開放；RyR 2的磷酸被磷酸酶水解下來，使RyR 2重新與FKBP 12.6結合，此時通道關閉。RyR 2的磷酸化程度決定RyR 2的功能狀態，RyR 2的活性調節需要適當的磷酸化，但是過度的磷酸化會影響通道的正常功能。在心力衰竭的過程中，RyR 2的結構和功能發生了改變，影響了心臟的舒縮功能[7,19]。有研究結果表明，在RBM 20敲除大鼠和RBM 20突變人中，RyR 2中1個24 bp外顯子表達升高，這說明RyR 2的24 bp外顯子受RBM 20表達量高低的調節。也有初步研究表明，RBM 20突變的人誘導多能干細胞來源的心肌細胞中，RyR 2表達升高[6]。RyR 2的突變與心律失常性右室心動過速和猝死有關，心律失常和猝死都是RBM 20相關DCM的表征。最近的研究表明，RyR 2功能缺陷不僅與心律失常有關，還與心肌病有關。但是RBM 20調節RyR 2的機制尚未明確，仍需進一步研究。

3.3 RBM 20與PI3K/Akt/mTOR信號通路PI3K/Akt/mTOR信號通路參與細胞的生長、增殖、分化等多種活動。生長因子激活PI3K，然后質膜上產生第二信使三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3)，PIP3促使Akt活化。活化的Akt磷酸化激活下游靶蛋白mTOR，進而誘導細胞的生命活動[20]。PI3K/Akt/mTOR信號通路參與心肌病。PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，可以減少心肌細胞凋亡程度，對缺血/再灌注損傷大鼠心肌具有保護作用；PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活調節下游靶的表達，減少急性心肌梗死的損傷；在心肌肥大動物模型中，PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活；PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活參與心肌細胞過氧化損傷過程。

外部刺激導致的錯誤剪接可能改變N2B和N2BA的比值，從而損害心臟收縮功能。實驗表明，RBM 20是胰島素激活的PI3K/Akt信號通路的下游底物，RBM 20是該通路下游連接胰島素與Titin剪接的重要蛋白。細胞水平上，胰島素或甲狀腺激素通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，增加RBM 20表達，進而增加N2B亞型的表達，而RBM 20敲除后，外部刺激不會改變N2B的表達；在細胞和糖尿病動物水平上，PI3K或mTOR激酶的抑制明顯降低了剪接因子RBM 20的蛋白質水平[15]，觀察到N2B亞型表達減少，而RBM20敲除后，未觀察到N2B亞型表達的變化。RBM20與PI3K/Akt/mTOR信號通路的研究較少，仍需進一步探索。

3.4 RBM 20與LDB 3/CaMKIIδ/CACNA1CLDB 3又稱Cypher基因，其編碼蛋白Cypher主要在橫紋肌中表達，位于肌小節的Z線上。LDB 3在收縮的機械應力下，保持著Z線的結構完整性，在肌細胞的結構和功能上起著重要作用[21]。對于LDB 3，外顯子4與外顯子5、6互相排斥，RBM 20通過使外顯子4、5、6同時表達，而調控LDB 3的組織特異性剪接。缺乏RBM 20時，外顯子4不表達，而外顯子5和6表達。在RBM 20敲除大鼠和RBM 20突變的個體的左心室組織中，外顯子4的表達下調[22]。

CaMKⅡδ是參與心臟中鈣處理、基因轉錄和信號轉導過程的關鍵酶，是通過對其底物受磷蛋白(phospholamban，PLB)、RyR和L型Ca2+通道(L-type Ca2+channels，LTCC)的磷酸化，進行興奮-收縮偶聯的調節劑。大多表現為4種亞型：δ-A、δ-B、δ-C、δ-9。健康成人心臟中，表達最多的亞型是δ-B和δ-C，但是RBM 20的缺失，誘導向更大的δ-A和δ-9亞型轉變。研究表明，RBM 20突變導致的CaMKⅡδ剪接受損是引起心肌病的重要原因之一。在體外，心臟發育期間敲除RBM 20，可檢測到RBM 20缺乏的心肌細胞在分化后表現出病理性CaMKⅡδ[23]。CaMKIIδ的異常剪接可以影響鈣穩態，并增加RBM 20突變個體猝死的風險。實驗證明，在RBM 20敲除小鼠心肌細胞中，CaMKIIδ剪接異常，Ca2+處理受到嚴重擾亂，LTCC活性明顯升高，導致L型Ca2+電流增加，收縮期Ca2+增加，肌漿網(sarcoplasmic reticulum，SR)Ca2+增加。LTCC是RBM 20敲除心肌細胞中Ca2+超載的潛在原因[24]，用LTCC拮抗劑維拉帕米阻斷L型Ca2+電流可完全抑制SR自發性Ca2+釋放，表明L型Ca2+電流密度升高可增加Ca2+內流，進而導致RBM 20敲除細胞內的SR Ca2+超載。

CACNA1C不同亞型的表達與心律失常有關。RBM 20突變引起CACNA1C改變，進而影響鈣離子穩態，增高RBM 20突變體猝死的風險[25]。

4 結語

隨著基因測序技術的發展，人們發現剪接因子調控基因的表達。RBM 20參與心臟關鍵基因的剪接，與心肌病密切相關，RBM 20調控Titin亞型轉換，被認為是導致心肌病的重要原因。但是由于RBM 20如何調節Titin剪接的機制尚不清楚，所以針對RBM 20治療心肌病的研究還處于理論階段。探尋是否有其他調節因子參與RBM 20調控Titin剪接過程，RBM 20與Titin pre-mRNA的結合位點，以及是否可以通過抑制RBM 20調節Titin亞型改善心肌損傷，都將成為治療心肌病的新靶點和新手段。RBM 20調控多種與心臟疾病密切相關的基因，但其機制未明，仍需進一步探索。