κ阿片受體中樞副作用評價方法和發(fā)生機制研究進展

馬 艷，劉景根，王瑜珺

(1.上海大學生命科學學院，上海 200444；2. 中國科學院上海藥物研究所，受體結構與功能重點實驗室,上海 201203)

疼痛是患者就醫(yī)的最起始信號，其中包括炎性疼痛、神經疼痛和癌癥晚期患者經受的癌痛等。疼痛影響的患者甚至超過糖尿病、心血管病和腫瘤患者之和。以嗎啡為代表的μ阿片受體激動劑是臨床治療中、重度疼痛的主要鎮(zhèn)痛藥，但此類藥物會引起用藥欣快感、耐受和呼吸抑制等副作用，存在成癮、藥物濫用和死亡的高用藥風險[1]。因此，尋找安全有效、副作用小的新型潛在鎮(zhèn)痛化合物是當務之急。為避免μ阿片類鎮(zhèn)痛藥物介導的副作用，長期以來κ受體激動劑都是新型鎮(zhèn)痛藥物的一個重要研究方向。

1 以κ阿片受體為靶標的代表藥物

κ阿片受體激動劑可以有效緩解疼痛、治療瘙癢，而不引起成癮、呼吸抑制和便秘等嗎啡樣副作用,已獲得越來越多的關注，但是其煩躁不安、鎮(zhèn)靜和致幻等中樞副作用也限制了這類化合物的成藥可能。目前，臨床以κ阿片受體為靶標的藥物，如噴他佐辛、納布啡、布托啡諾等均為κ/μ混合激動藥物，κ阿片受體選擇性激動劑只有2009年日本上市的用于尿毒癥患者止癢藥物納呋拉啡。

1.1 噴他佐辛(pentazocine)70年代發(fā)現(xiàn)的苯基嗎喃類鎮(zhèn)痛藥物，主要激動κ阿片受體,對μ受體具有部分激動或較弱的拮抗作用。噴他佐辛適用于中、重度鎮(zhèn)痛,具有較弱的焦慮副作用和較低的成癮性。臨床廣泛用于手術痛、慢性疼痛、癌痛等。該藥物術后鎮(zhèn)痛的不良反應主要為惡心、嘔吐和多汗等,且發(fā)生率較低[2]。有文獻報道，噴他佐辛還可以用于治療其他鎮(zhèn)痛方法引起的不良反應[3]。

1.2 納布啡(nalbuphine)納布啡是一種半合成混合型阿片受體激動-拮抗劑,為強效κ阿片受體激動劑，對δ受體無激動作用,對μ受體具有拮抗作用，拮抗藥效是噴他佐辛的11倍,足以拮抗掉嗎啡等μ激動劑引起的呼吸抑制。具有鎮(zhèn)痛效應強,呼吸抑制、惡心嘔吐、皮膚瘙癢等副作用較弱的優(yōu)點,廣泛應用于術后鎮(zhèn)痛、臨床麻醉等。自1965年合成以來,在國外得到廣泛應用。2015國產化上市，近兩年國內臨床應用逐漸增多[4]。

1.3 布托啡諾(butorphanol)14-羥基嗎啡喃系列鎮(zhèn)痛藥物，是一種合成的阿片受體混合激動拮抗劑，其體外阿片受體親和力為1 ∶4 ∶25(μ ∶δ ∶κ)，為強效κ阿片受體完全激動劑，對δ受體激動活性低，對μ受體有部分激動作用。該藥物具有鎮(zhèn)靜作用，但成癮性低，無耐藥性，無煩躁不安、焦慮等不適感，呼吸抑制弱[5]。1992年，美國開發(fā)出布托啡諾鼻腔噴霧制劑用于緩解劇烈疼痛。

1.4 地佐辛(dezocine)阿片受體混合激動拮抗劑，鎮(zhèn)痛作用強，而副作用弱。2009年，揚子江藥業(yè)集團在中國將地佐辛按3.1類新藥開發(fā)，獨家上市后，迅速占據(jù)國內鎮(zhèn)痛藥物市場。2016年，地佐辛的銷售額在全國達到6.3億美元，占全國阿片類鎮(zhèn)痛藥市場的45%以上。早期研究表明，地佐辛對μ受體具有激動作用，在動物和人類中均能產生與嗎啡等效甚至更強的鎮(zhèn)痛作用[6]。同時，地佐辛表現(xiàn)出一定的μ拮抗活性。與μ完全激動劑嗎啡相比，地佐辛安全性較好。根據(jù)以上資料，地佐辛被認為是μ部分激動劑[6]。Liu等[7]對地佐辛的分子靶點進行表征，證實地佐辛為κ部分激動劑。由于地佐辛結構上與噴他佐辛有相關性，地佐辛最初被鑒定為κ受體激動劑，體外功能測定表明地佐辛為κ受體拮抗劑,去甲腎上腺素和5-羥色胺重攝取抑制劑。近期我們課題組結合體外功能性[35S] GTPγS實驗和體內藥效實驗證實，地佐辛是κ部分激動劑和μ部分激動劑，對μ受體的親和力高于κ受體[8]。

1.5 納呋拉啡(nalfurafine，TRK-820)Nagase等[9]于1998年發(fā)現(xiàn)新型κ受體激動劑-納呋拉啡。Wang等[10]明確了納呋拉啡對κ阿片受體的高選擇性。納呋拉啡具有較強的G蛋白偏向性，動物實驗結果顯示，鎮(zhèn)痛劑量下不引起煩躁、鎮(zhèn)靜等作用，臨床不產生致幻，因此，納呋拉啡被定位為低副作用的鎮(zhèn)痛劑和止癢劑[11]。然而，最近在大鼠顱內自我刺激實驗中發(fā)現(xiàn)，高劑量納呋拉啡會誘導煩躁不安厭惡效應，因此，納呋拉啡的G蛋白偏向特性可能不足以保證它的安全性[12]。此外，臨床試驗顯示，納呋拉啡在鎮(zhèn)痛劑量下存在嚴重的鎮(zhèn)靜作用，但是這種副作用在低劑量(止癢劑量)下可避免[13]。2009年，納呋拉啡軟膠囊劑型在日本上市，用于治療尿毒癥患者血液透析相關瘙癢癥。2015年及2017年，納呋拉啡在日本獲批用于治療慢性肝病患者瘙癢癥及腹膜透析患者瘙癢癥。2018年，中國生物制藥公司三生制藥和日本東麗公司(Toray)簽訂獨家許可協(xié)議，在中國內地開發(fā)及商業(yè)化該產品。納呋拉啡從小鼠模型成功轉向臨床市場，并轉向商業(yè)化發(fā)展，最終被血液透析病患與尿毒癥瘙癢患者接受，是目前κ阿片類選擇性藥物領域中唯一市售產品。

1.6 KORSUVA(CR845/difelikefalin)由Cara Therapeutics公司開發(fā)，是一種作用于外周的新型高選擇性κ受體激動劑，CR845在人和動物中均表現(xiàn)出強效的鎮(zhèn)痛、抗炎和止癢特性。由于CR845難以穿透血腦屏障，可以有效避免中樞副作用。該注射劑于2018年初啟動針對術后痛和止癢的關鍵性臨床III期試驗。

2 κ阿片受體激動劑伴隨的副作用及評價方法

在臨床前研究階段，動物模型和研究方法的恰當選擇是發(fā)現(xiàn)和評估新型先導藥物的重中之重。κ受體激動劑產生鎮(zhèn)痛的同時也會伴隨鎮(zhèn)靜、煩躁不安和致幻的發(fā)生。鎮(zhèn)靜的評價方法和手段較多，自發(fā)活動和轉輪實驗均能作為鎮(zhèn)靜評價指標。目前，國內外尚沒有針對致幻的動物行為研究方法。煩躁不安作為一種負性情緒，評價有一定的難度，近年來對κ受體激動劑，尤其是G蛋白偏向性配體的開發(fā)促進了該評價方法的成熟。

2.1 條件位置厭惡(conditioned place aversion, CPA)激活κ阿片受體會引起人類的煩躁不安和嚙齒動物的類似煩躁狀態(tài)[14]。在嚙齒動物中，CPA行為是煩躁不安的客觀測量方法[15]。通過將特定的環(huán)境信號與藥物引起的情緒搭配，使動物對二者形成聯(lián)系并建立條件反射，當動物再次處于相同環(huán)境時，會表現(xiàn)出厭惡和逃避。CPA模型建立分為3個時期：條件化前期(1 d)、條件化期(6 d)、測試期(1 d)。測試期動物在伴藥箱一側的停留時間與條件化前期動物在伴藥箱中的停留時間的差值，即為CPA值[16]。Anderson等[17]用CPA模型評價選擇性κ激動劑U62066介導的煩躁情緒，發(fā)現(xiàn)成年大鼠給予0.1、0.2 mg·kg-1U62066均表現(xiàn)出明顯的CPA。Laman-Maharg等[18]觀察到κ受體激動劑U50488介導明顯的煩躁不安，同時存在性別差異，在♂加利福尼亞小鼠中，10 mg·kg-1的U50488可以引起CPA，而對于♀加利福尼亞小鼠，2.5 mg·kg-1U50488即可引起明顯的CPA。值得注意的是，應激也會促進內源性強啡肽原釋放，進而激活κ受體產生CPA，但該作用依賴促腎上腺皮質激素釋放因子(corticotropin-releasing factor，CRF)。由CRF引起的CPA可被強啡肽基因缺失、κ受體拮抗劑或CRF2受體拮抗劑antisauvigine-30阻斷。但是，外源性κ激動劑U50488直接誘導的CPA不可被CRF2受體拮抗劑阻斷[14]。

2.2 顱內自刺激(intracranial self-stimulation，ICSS)κ受體激活在動物中引起的煩躁不安是難以直接測量的，CPA模型中體現(xiàn)出的厭惡指數(shù)可以作為一個指標[19]，但是厭惡情緒本身是一個復雜的過程，涉及眾多腦內信號分子。有研究將動物對腹側被蓋區(qū)- ICSS低應答頻率反映出的快感缺失，作為體現(xiàn)κ受體激動引起的煩躁不安的另一個指標。在該實驗中，將電極埋于鼠腦，通過動物自己按開關通電流，以進行自刺激。這是Olds等[20]發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象，在獎賞系統(tǒng)中，動物按開關的頻率可高達每小時5 000次。ICSS的產生部位為以丘腦下部為中心，擴展到大腦邊緣系統(tǒng)及中腦頂蓋，而大腦新皮質、丘腦和小腦無此作用。通過按開關引起的對腦的獎賞刺激，可使動物學習。有效學習與自刺激有效部位得到獎賞有一定聯(lián)系。將能產生自刺激的部位稱為獎賞系統(tǒng)，與此相對，將動物會躲避按開關的刺激部位稱懲罰系統(tǒng)。ICSS作為一種實時監(jiān)測方法，是對CPA實驗的有力補充。κ受體激動劑通過抑制腦中獎賞效應增加ICSS閾值。另外，系統(tǒng)操縱刺激頻率產生“頻率-反應率”曲線(類似于藥理學劑量-效應曲線)，實驗通過頻率曲線的改變評價動物情緒。ICSS中這種“曲線移位”方法的優(yōu)點是它可以將刺激敏感度與動物的運動應答能力分開[21]。具體而言，頻率-速率曲線的橫向移動通常代表刺激的敏感度變化，而垂直移位被解釋為運動效應的改變。研究表明，κ受體激動劑U50488、U69593介導動物產生煩躁不安，均會增加ICSS閾值。而κ受體拮抗劑norBNI、5′-acetamidinoethylnaltrindole(ANTI)預處理會阻斷U50488、U69593介導的ICSS閾值升高[19,22]。實驗證明，具有G蛋白偏向特性的阿片受體激動劑RB-64，triazole 1.1，不產生明顯的煩躁不安，不會增加ICSS閾值[22,23]。臨床止癢藥物κ受體激動劑納呋拉啡在小鼠ICSS實驗中也不會引起閾值的升高，提示該藥物在止癢劑量范圍內不產生煩躁不安副作用[16]。

3 κ阿片受體介導煩躁不安的潛在分子機制

近年來，在利用CPA和ICSS評價κ受體激動劑煩躁不安副作用的同時，介導該作用發(fā)生的分子機制也引起眾多關注。

3.1 β-arrestin信號通路“功能選擇性”也叫“激動劑偏向性”，是用來描述G蛋白偶聯(lián)受體配體選擇性地激活G蛋白信號通路，而不是激活包括G蛋白、β-arrestins和(或)激酶在內的所有信號。功能選擇性意味著，有不同偏向性的配體會產生不同的行為效應。Bruchas等[15]發(fā)現(xiàn)，κ受體誘導的p38 MAPK磷酸化介導了動物煩躁不安的發(fā)生，與鎮(zhèn)痛作用無關，并且p38 MAPK的激活是由β-arrestin2通路介導[24]，表明β-arresin2通路和煩躁不安副作用相關。Triazole 1.1是由Brust等[22]新發(fā)現(xiàn)的G蛋白偏向性κ受體激動劑，他們發(fā)現(xiàn)Triazole 1.1和傳統(tǒng)κ受體激動劑一樣具有鎮(zhèn)痛和止癢作用，但不會誘發(fā)鎮(zhèn)靜、煩躁不安和多巴胺釋放減少。但是，有研究利用β-arrestin2敲除鼠發(fā)現(xiàn)，敲除β-arrestin2損傷了動物的行為協(xié)調性[23,25]，動物仍然表現(xiàn)出煩躁不安，同時也不影響κ激動劑的鎮(zhèn)痛和止癢作用，證明β-arrestin通路和動物的運動協(xié)調性相關，但和煩躁不安通路無直接相關性。他們進一步對G蛋白偏向性配體RB-64進行檢測，發(fā)現(xiàn)RB-64具有明顯的鎮(zhèn)痛作用和CPA副作用，但沒有鎮(zhèn)靜和快感缺失副作用[23,25]。因此，現(xiàn)有資料表明，β-arrestin偏向性信號傳導與煩躁不安、運動失調有一定的相關性。目前，主要利用偏向因子(G蛋白/β-arrestin2)來描述配體對G蛋白和β-arrestin2的偏向性，偏向因子計算：對G蛋白的激動能力(35S GTPγS binding實驗)/對β-arrestin2的招募能力(DiscoveRx Path Hunter Enzyme Fragment Complementation，EFC技術)[26]。

3.2 p38 MAPK研究表明，κ受體介導的煩躁不安依賴p38MAPK通路的激活[15,24]，而p38 MAPK的激活由于G蛋白偶聯(lián)受體激酶3引起受體磷酸化，進而招募β-arrestin2所致[27]。本課題組前期也發(fā)現(xiàn)，κ阿片受體激動劑U50488介導的CPA依賴杏仁核p38 MAPK磷酸化，選擇性p38抑制劑SB203580可以阻斷U50488介導的CPA行為[15,28]。Ehrich等[29]發(fā)現(xiàn)，多巴胺神經元中的p38αMAPK在κ阿片受體介導的厭惡情緒中起關鍵作用，腹側背蓋區(qū)內κ阿片受體活化引起p38αMAPK磷酸化是κ阿片受體介導條件性位置厭惡所必需的。恢復κ阿片受體敲除鼠腹側背蓋區(qū)多巴胺能神經元中κ受體的表達，動物重新產生κ阿片受體依賴的負性情緒。進一步發(fā)現(xiàn)，在多巴胺能神經元中，κ阿片受體激活p38αMAPK引發(fā)煩躁不安負性情緒，而κ阿片受體激活p38αMAPK與κ阿片受體抑制多巴胺釋放過程無關。

3.3 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路2018年，Liu等[30]利用磷酸化蛋白質組學方法，對κ受體信號介導的信號作了全面的評價，通過對近50 000個不同的磷酸化位點定量分析，發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路與κ受體介導的煩躁不安副作用存在相關性。mTOR復合物能激活p70S6激酶，進而增加核糖體蛋白S6的磷酸化,導致蛋白質合成增加。他們發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR通路激活可以消除κ受體引起的CPA行為。Liu等[16]進一步利用該方法結合行為學實驗，比較了經典κ受體激動劑U50488和不會引起煩躁不安副作用的納呋拉啡的異同，證明mTOR信號通路介導κ阿片受體激活引起的煩躁不安厭惡情緒。在紋狀體和皮質中，U50488激活mTOR通路程度明顯強于納呋拉啡，而且mTOR抑制劑可以阻斷U50488誘導的CPA。另外，可以引起CPA的U50488和不產生CPA的6′-GNTI在調控小鼠紋狀體和皮質中mTOR通路方面也存在差異[30]。因此，κ阿片受體激動劑激活mTOR通路的能力或許可以作為區(qū)分κ阿片受體激動劑產生不同程度煩躁不安的方法。值得注意的是，p38MAPK通路的激活在該方法中未被發(fā)現(xiàn)。

阿片類藥物是最有效的止痛藥，但長期使用的嚴重副作用限制疼痛治療的有效性、安全性，導致全世界范圍內的阿片類藥物濫用。與κ阿片受體激動劑不同，κ阿片受體激動劑在鎮(zhèn)痛止癢同時不引起欣快感，有效避免了藥物濫用和成癮，而且κ激動劑不會引起呼吸抑制，極大地增加了臨床用藥的安全性，相信κ阿片受體激動劑研究將為設計開發(fā)新型阿片鎮(zhèn)痛藥開辟新的道路。