青貯飼料中霉菌毒素的產生及對反芻動物健康的影響

趙雪嬌，么恩悅，鄭 健，劉 鑫，張永根

（東北農業大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱150030）

全株玉米青貯是發展草食動物養殖業不可或缺的基礎飼料之一，也是最經濟的飼料。但青貯中存在大量細菌、霉菌以及其有毒代謝產物，不僅會對家畜的健康產生不利影響，甚至會經機體代謝進入人類食品中，如牛奶中的黃曲霉毒素M1。因此在通過理化性質、發酵指標評價青貯飼料質量的同時，霉菌、霉菌毒素等生物指標也是必要的參數。霉菌毒素是由真菌產生的次級代謝產物，主要包括黃曲霉毒素（AFs）、赭曲霉毒素 A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、伏馬菌素（FUM）等（Loi等，2017；Gallo 等，2016；Gallo 等，2015；Bennett等，2003）。 其主要存在于谷物、青綠和青貯飼料中，合成受環境和生理條件的影響（Magan 等，2007；Whitlow 等，2005）。 本文主要對青貯飼料生產過程中出現的各種霉菌、霉菌毒素及其對反芻動物健康的影響，以及預防措施進行綜述，旨在為控制青貯飼料制作和飼喂過程中霉菌毒素的污染，降低經濟損失提供參考。

1 青貯調制過程及不同微生物菌群的作用

標準的青貯生產過程包括在最適期收割破碎，快速裝填至青貯窖，使用有效的有機酸及乳酸菌等青貯添加劑，壓實、覆蓋、貯存等。青貯原料經過這些加工過程貯到青貯窖之后，在發酵和貯藏過程中生理生化和微生物菌群發生變化。青貯飼料的發酵過程包括好氧發酵和厭氧發酵兩個過程，首先是好氧發酵過程，好氧菌活動加強，氧氣含量逐漸降低；隨后進入厭氧發酵過程，乳酸菌（LAB）等厭氧菌大量繁殖，pH迅速下降直至穩定。有研究表明，良好青貯飼料的制作，其主導發酵菌為LAB，可以快速降低pH，有效抑制酵母菌和霉菌的生長繁殖，有利于青貯飼料的保存，青貯典型的LAB包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、小球菌屬（Pediococcus）、腸球菌屬（Leuconostoc）、明串珠菌屬（Enterococcus）和韋氏菌屬（Weissella）（Bao，2016）。 青貯原料質量差和管理疏漏均可能導致微氧耐酸菌和霉菌等有害微生物生長，最終產生霉菌毒素污染（Scudamore 等 ，1998；Coulombe 等 ，1933）。 玉 柱 等（2004）研究指出，品質好的青貯飼料是家畜健康生長和高生產性能的重要因素，并且貯存后營養損失少，發酵過程能夠產生芳香味道的有機酸，不僅能夠提高家畜對青貯飼料的適口性及采食量，并且各種有機酸可參與反芻動物體內化合物代謝，合成乳糖等各種有機物，進而提高家畜畜產品的產量和品質。

2 青貯飼料中霉菌及其毒素的產生

2.1 青貯飼料中主要霉菌及毒素的種類 無論飼料是在田間還是在貯存過程中，霉菌的生長都是非常普遍的。收獲前感染霉菌毒素，貯藏時還可能存在，而且在貯藏過程中經常能保持穩定存在很長一段時間。此外，延遲收獲、放料速度慢、嚙齒動物造成的植物損害等都會為霉菌增殖和霉菌毒素產生創造條件。

青貯飼料中適宜的水分活度、溫度和pH能夠使真菌生長并促進真菌毒素的產生 （Egal等，2005）。其中產毒真菌主要包括曲霉屬、鐮刀菌屬、青霉菌屬、麥角菌屬和內生真菌屬等（Richard等，2003；Weidenborner等，2001）。曲霉菌、鐮刀菌和青霉菌是一類會對農業和畜牧業生產產生嚴重危害的產毒真菌屬（Aragon等，2011）。其中曲霉屬真菌主要包括黃曲霉、寄生曲霉、赭曲霉及棒曲霉等，可產生 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、棒曲霉毒 素 等 （Richard 等 ，2003；Weidenborner 等 ，2001）。鐮刀菌屬真菌主要包括輪狀鐮刀菌、層生鐮刀菌、黃色鐮刀菌、梨孢鐮刀菌及克地鐮刀菌等真菌，可產生 ZEN、DON、T-2、HT-2、蛇形菌素及瓜萎鐮菌醇等 （Richard 等，2003；WeidenbёOrner等，2001）。青霉菌屬真菌主要包括鮮綠青霉、純綠色青霉、桔青霉、婁地青霉、圓弧青霉以及棒形青霉等真菌，可產生OTA、桔霉素、棒曲霉素以及異煙棒曲霉素等 （Richard等，2003；Weidenborner等，2001）。

有研究指出，規模化牧場的青貯窖在開窖后15 d，青貯窖的前端和頂部有氧氣進入，會有真菌生長并且產生AFs（Cavallarin等，2011）。 也有研究發現，在青貯之前玉米未受到AFB1的污染，而在發酵后受到AFB1污染的樣品達17%，其中有67%的青貯玉米超過了所規定家畜飼料中AFB1含量的限定標準（20 μg/kg）（Pereyra 等，2008）。除此之外，優質的青貯還與其在制作時的緊實度有密切關系，當緊實度越高時，其氧氣含量越低，有助于乳酸菌的快速繁殖和pH的迅速降低，將有效抑制霉菌的生長，進而有效減少霉菌毒素的產生。

2.2 青貯飼料中霉菌毒素的交互作用 近年來，引起研究者們廣泛關注的是同一種霉菌會產生多種霉菌毒素，且同一種毒素可能由不同的霉菌產生。各霉菌毒素間會產生復雜的交互作用，這種互作形式包括：接觸多種不同霉菌毒素的受感染動物的反應與對單獨每種霉菌毒素的反應的總和相同（累加作用），或其反應比對單獨每種霉菌毒素的反應總和要輕 （拮抗作用）或更嚴重 （協同作用），而實際生產中產生更多的是累加或協同作用，較少出現拮抗作用（Diaz，2005）。 因此，防止多種霉菌毒素在青貯中同時污染尤為重要。

幾種真菌毒素共同出現的情況在飼料中經常發生，如果飼料原料貯存在有利于一種霉菌生長和產生霉菌毒素的特定條件下，則同樣的條件也適合其他霉菌在該飼料原料中生長并產生霉菌毒素，這會導致同一飼料受到來自不同霉菌的多種霉菌毒素的污染（Diaz，2005）。研究表明，最常見的霉菌毒素組合是DON和ZEN，DON污染被認為是其他霉菌毒素污染，特別是鐮刀菌毒素發生的潛在標志物。這些毒素產生后，均能夠在青貯飼料中生存且保持穩定，對動物的健康產生巨大威脅（Aragon等，2011）。此外，霉菌毒素的互作除了包括各毒素之間的交互作用，還包括霉菌毒素和營養物質間的互作、霉菌毒素與傳染性疾病間的互作。

3 霉菌毒素對反芻動物健康的影響

霉菌的生長會直接損失飼料中的養分，然后產生對人類、動物和植物具有較大毒性的次級代謝產物。通過消化、吸入或皮膚接觸均會對動物產生不良反應，如降低飼料營養水平、影響飼料適口性、減少反芻動物采食量、易感染疾病、降低生產性能和生殖能力、免疫抑制和死亡等（Zain，2011；Fink-Gremmels 等，2008；Finkgremmels 等，2007；Whitlow 等，2005；Scudamore 等，1998）。 每年動物都要消耗數百萬噸污染了各種霉菌毒素的草料，有些草料，如干草、秸稈或青貯料，在收獲前或貯藏過程中就感染了真菌。粗飼料是飼喂反芻動物最經濟的飼料資源。因此粗飼料中的霉菌毒素污染造成的經濟損失非常嚴重。

有研究表明奶牛在采食AFB1后，會迅速吸收進入血液，經肝臟轉化為AFM1，但由于瘤胃對AFM1的降解率很低，而且瘤胃對AFs主要的降解產物黃曲霉毒素醇的毒性與原毒素的毒性相似，因此反芻動物并不具備有效防止AFs中毒的能力（Driehuis，2013）。ZEN 被采食后，瘤胃微生物將其降解為α-玉米赤霉烯醇，研究表明，其毒性是原毒素的4倍，對奶牛繁殖性能產生更明顯的影響。DON被采食后，瘤胃微生物會破壞DON分子氧環，形成去環氧脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，從而被降解，但有研究顯示該物質可能會被重新氧化為DON，對蛋白質合成產生抑制作用。FB1在瘤胃中代謝極少，被吸收入血造成奶牛生產性能下降，嚴重損傷臟器。T-2毒素對奶牛而言是一種嚴重的胃腸刺激物，會導致腸道的出血、壞死，高濃度的T-2會導致肝臟、肺臟、心臟出現充血或炎癥反應。OTA在瘤胃中可轉化為赭曲霉毒素-α，后者雖然毒性低，但卻有一定的遺傳毒性。奶牛攝入霉菌毒素污染的飼料后，對動物機體產生嚴重的毒性作用，部分還會經奶排出，以及在機體內殘留，對人類和動物健康及食品安全造成嚴重威脅。尤其是對瘤胃功能尚不健全的犢牛，微生物區系不夠穩定，對霉菌毒素的抵抗力較弱，采食霉菌毒素污染的日糧會產生嚴重不利影響。

4 青貯飼料受霉菌及其毒素污染的預防措施

4.1 青貯收獲前田間管理 青貯飼料在收割過程中易卷入泥土，并且其水分含量大、營養豐富，因而在原料收獲、運輸、貯藏及飼喂取料等過程中，均有可能導致霉菌大量繁殖，產生霉菌毒素等有毒代謝產物。一般來說，在水分含量大、極端溫度、濕度、干旱條件、昆蟲損害和一些不規范的田間管理的環境條件下，將導致霉菌的產生，進而引起嚴重的真菌毒素污染（Teller等，2012；Cotty等，2007；Munkvold，2003；Hussein 等，2001）。 例如，導致黃曲霉毒素積累的主要氣候條件是高溫，低降雨和嚴重干旱；鐮孢菌素通常與低氣溫和高濕度的生長季節相關（Reyneri，2006；Munkvold，2003）。鐮刀菌屬污染通常和溫度較低以及在植物生長過程中過度濕潤相關。因此，霉菌毒素是否達到或超過產生危害的濃度，與每年的天氣波動直接相關。在青貯生產過程中，收獲前環境變化和田間管理可直接影響霉菌及其毒素污染情況，并且飼料中超過90%的霉菌毒素產生于田間。因此，避免青貯飼料受到霉菌毒素污染首先應注重作物生產的過程，加強田間管理，對收獲活動進行嚴謹的規劃。

4.2 合理使用青貯添加劑 青貯管理不當會引起產毒真菌和霉菌毒素的產生 （Storm等，2008；Fink-Gremmels等，2007；Richard 等，2007）。因此，通常在青貯飼料制作時添加發酵劑來抑制霉菌的生長和霉菌毒素的污染，酸就是最為常見的青貯飼料添加劑。Virtanen在20世紀20年代后期提出用無機酸保存飼料作物的方法 （AIV青貯法），添加劑由30%鹽酸和40%硫酸按92∶8的比例配制，使用時加4倍水稀釋，稀釋液按50~60 g/kg鮮草比例添加到青貯料中，可抑制有害微生物如大腸桿菌、酪酸菌的生長，刺激LAB的生長，使pH進一步下降。乳酸和乙酸對霉菌的生長有抑制作用，丙酸和丁酸作為霉菌抑制劑更為有效。青貯生產中可通過添加有機酸產生酸性環境來促進乳酸菌等有益菌的生長，同時由于未分解的有機酸（pH依賴性）有更強的滲透細胞結構的能力，因此其會影響霉菌的生長。

一般情況下，牧草和飼料作物上附著的LAB數量不足，且多為不良菌種（含異型乳酸菌105cfu/g鮮質量)，而且青貯早期LAB繁殖非常緩慢，導致有害微生物增殖，使LAB迅速增殖并占主導地位的有效濃度為105cfu/g鮮質量。因此，生產中在青貯時會添加LAB，使青貯料快速產生大量乳酸，減少有害微生物的活動。研究發現不同種類LAB在一定的環境中起不同作用，多類型乳酸菌菌種的配合使用被廣泛應用。

此外，還包括許多其他不同作用的青貯飼料發酵劑。如綠汁發酵液（PFJ），與乳酸菌活菌制劑類似，其優點是制作工藝簡單、生產成本低并且環保。該方法是在青貯裝填之前將原料鮮草綠汁在厭氧條件下進行發酵，制備綠汁發酵液，使野生LAB大量繁殖，作用類似乳酸菌添加劑（張增欣等，2006）。纖維素酶是由真菌或細菌產生的一種多酶復合體，是可促進發酵的復合型制劑。青貯飼料中添加的纖維素酶制劑中包含多種降解細胞壁的酶組分，其中含有纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、果膠酶及氧化還原酶類。非蛋白氮、氨作為提高玉米青貯品質的添加劑，可提高粗蛋白質的含量，降低好氧微生物的生長潛力。氨通常以無水氨、氨水的形式添加，可增加玉米青貯料的不溶性氮成分。尿素可以增加青貯料的粗蛋白質含量，同時具有較好的防腐作用。

4.3 收獲后管理 青貯貯存后對真菌和真菌毒素的控制，主要取決于對貯藏環境條件的控制（Mansfield 等 ，2008；Mansfield 等 ，2007； Reyneri等，2006）。良好的青貯環境、快速發酵和低氧氣環境等有利條件可減少霉菌生長和霉菌毒素的污染（Tapiaa 等 ，2015；Johansson 等 ，2010；Mansfield等，2007；Mcdonald 等，1991）。然而在微氧、低 pH的環境下，有些微生物依然可以生存（Mcdonald等，1991）。因此，對于青貯飼料受霉菌及其毒素污染的預防措施應該在田間就被采取，且在青貯前和青貯過程中要有良好的、持續的青貯管理方法。如在青貯制作完初期，下沉量大，應嚴防透氣、漏水；防止青貯飼料二次發酵。飼料取樣飼喂時應使用取料機取料，保持截面整齊，減少空氣進入；及時清理霉變不合格的青貯。

5 小結

青貯飼料是反芻動物日糧的重要組成部分，其在收獲、發酵以及取用過程中均有可能受到霉菌毒素的污染，其中主要包括AFB1、ZEA、DON、OTA、FUM等。青貯中真菌及毒素污染不僅會嚴重影響飼料適口性，降低其營養價值，還會對反芻動物健康產生嚴重影響，從而降低生產性能。霉菌毒素及其代謝產物也會出現在動物產品中，危害食品安全，對人類健康產生威脅。深入了解青貯飼料中真菌及其毒素的危害，研究其發生及發展規律，通過加強青貯前田間管理，嚴格管控青貯調制過程中關鍵步驟，使用適宜的青貯飼料微生物發酵劑，并制定快速、合理的毒素分析檢測手段，對降低其對動物和人類健康的危害具有重要意義。