農桿菌注射法瞬時轉化荔枝果實組織的研究

王樹軍 王果 李煥苓 孫進華 李芳 王家保

摘? 要? 為了尋找一種高效的荔枝果實瞬時基因表達方法，本研究以荔枝品種‘新球蜜荔（Litchi chinensis Sonn. var. ‘Xinqiumili）為試材，利用農桿菌注射法對荔枝果實組織進行轉化，研究了果實發育時期、菌株種類、注射部位、取樣時間、菌液濃度等對轉化效率的影響。結果表明：選擇果肉已完全包裹種子的Ⅱb期果實進行連體注射，在果柄、果皮、種子、果肉分別注入OD600值為2.4的農桿菌菌株GV3101，4 d后取樣進行檢測，4個組織的GUS染色率較高。本研究成功建立了適用于荔枝果實的基因瞬時表達系統，為今后快速鑒定荔枝果實相關基因功能提供了基礎。

關鍵詞? 農桿菌注射;‘新球蜜荔果實;瞬時表達;GUS檢測

中圖分類號? S667.1? ? ? 文獻標識碼? A

Transformation of Tissues of Litchi Fruit with Injection of Agrobacterium

WANG Shujun， WANG Guo， LI Huanling， SUN Jinhua， LI Fang， WANG Jiabao*

Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract? To find an efficient transient gene expression method for litchi， the fruits of ‘Xinqiumili were used as the material to transform fruit tissues by Agrobacterium in this study. The effects of fruit developing stage， bacterium strains， injection sites， sampling time， bacteria solution concentration on the transformation efficiency were studied. The results showed that the GUS staining rates were better in four tissues under the condition that Agrobacterium strain GV3101 with OD600 of 2.4 was injected into the stalk， peel， seed and pulp of the stage Ⅱ b fruit with the pulp completely wrapped in the seed in vivo， and the fruits were sampled for detection after four days of injection. The transient gene expression system of litchi fruits was successfully established， which laid a foundation for the rapid identification of related genes of litchi fruits in the future.

Keywords? injection of Agrobacterium; ‘Xinqiumili fruit; transient expression; GUS detection

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.013

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是華南重要的特色水果，荔枝產業在區域農業經濟中占有重要地位。培育荔枝優良新品種是進行品種結構調整、解決產業重大問題的基礎。基因工程育種具有可定向改良荔枝性狀、縮短育種周期、提高育種效率的優勢。獲得重要功能基因及其調控元件如啟動子等是基因工程育種的基礎，近年來逐漸成為荔枝生物學研究的熱點[1-2]。前期人們通常以擬南芥和煙草等模式植物來研究荔枝基因及其啟動子功能[3-4]，但是利用這些轉化系統所獲得的研究結果都無法完全真實反映出與果實性狀有關的基因功能[5]。荔枝離體再生困難[6]，限制了利用傳統的轉基因技術體系開展荔枝基因功能研究的效率。因此需要尋求一種新的快速高效技術體系用于荔枝果實基因及其啟動子的功能研究。果實注射法是一種以肉質果實為轉化材料的基因瞬時表達驗證新方法，操作簡單、周期短。前人利用該方法已在蘋果、梨、番茄、桃、草莓、橙等肉質果實中成功開展了基因功能研究[7]，但是在荔枝果實中的應用還未見報道。本研究對影響荔枝果實注射法的多種因素進行探索，建立了瞬時表達系統，以期為快速鑒定荔枝果實相關基因功能提供基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究在中國熱帶農業科學院試驗基地果園進行，選取‘新球蜜荔（Litchi chinensis Sonn. var. ‘Xinqiumili）品種為材料。注射方式為連體注射和離體注射。連體注射是在果實發育期，選擇無病蟲害的果實，不摘離果樹直接在樹上進行，果面不做消毒及其他處理。離體注射是將果實采摘回實驗室進行，所需果實采后3 h內運回實驗室，挑選無病蟲害和無機械損傷的果實，先用0.1% HgCl2溶液消毒1 min，再用滅菌蒸餾水沖洗3次，將沖洗好的果實用吸水紙吸干水分后用于注射實驗。

農桿菌菌株選用GV3101和EHA105，植物表達載體選用包含GUS基因的pCAMBIA1301質粒。

1.2? 方法

1.2.1? 農桿菌注射液的準備? 用熱激轉化法將質粒pCAMBIA1301分別轉入農桿菌EHA105和GV3101感受態細胞，恢復培養后涂板在添加了卡那霉素（Kan）100 mg/L和利福平（Rif）100 mg/L的LB固體培養基上，利用菌落PCR方法鑒定出陽性單菌落后搖菌培養，液體培養基為LB+Kan 100 mg/L+Rif 100 mg/L，在200 r/min，28 ℃條件下，振蕩培養至OD600值為0.8。再取1 mL菌液于含有Kan 100 mg/L+Rif 100 mg/L+乙酰丁香酮（AS）100 ?mol/L的100 mL LB液體培養基中在相同條件下擴大培養至OD600為0.8，收集菌液轉入50 mL離心管中，5000 r/min離心收集菌體，去上清后以添加了AS（100 ?mol/L）的MS液體培養基為重懸液重懸菌體備用。

1.2.2? 轉化效率影響因素研究? 依據李建國等對荔枝果實發育時期的新劃分標準[8]，分別取果實發育Ⅰ期（雌花授粉后35 d左右）、Ⅱa期（雌花授粉后55 d左右）和Ⅱb期（雌花授粉后70 d左右）的果實，研究不同發育時期注射對轉化效率的影響。選取農桿菌菌株GV3101和EHA105進行對比實驗，研究不同菌株種類對轉化效率的影響。為了最大限度減少注射傷口損傷，選擇使用針頭較細的1 mL無菌注射器將菌液分別注入果柄、果皮、種子、果肉，其中果柄注射是橫向刺穿后注入，果皮注射時刺穿外果皮但不刺透內果皮，果肉和種子注射時分別從果蒂和果頂部位注入，研究注射部位對轉化效率的影響。分別在注射后2、4、6、8 d摘果取樣進行GUS染色，研究注射后取樣時間對轉化效率的影響。將菌液分別重懸至OD600值為 0.8、1.6、2.4、3.2進行注射，研究菌液濃度對轉化效率的影響。

選取相同發育時期的連體和離體果實，分別在果柄、果皮、種子、果肉部位，采用1 mL的無菌注射器將菌液注入，至有菌液溢出為止，每次注射完后要去除果實表面多余的菌液，研究離體注射和連體注射2種方式對轉化效率的影響。

每個處理選取8個果實為1組重復，重復3次。

1.2.3? GUS組織化學染色? 取注射后2、4、6、8 d的連體注射果實和離體注射果實，分別取注射的果皮、果柄、果肉、種子，切成小塊，用無菌水清洗之后置于GUS染液[50 mmol/L pH 7.0磷酸鈉緩沖液，0.1 mmol/L K3[Fe（CN）6]，0.1 mmol/L K4[Fe（CN）6]，1 mmol/L Na2EDTA，0.1% Triton-100，20%甲醛，0.5mg/mL X-Gluc]中，37 ℃染色過夜，酒精脫色后觀察染色結果并統計GUS染色率。GUS染色率=（顯色的果實數量/總注射果實數量）×100%。

1.3? 數據處理

采用Excel 2010軟件進行數據統計，采用Duncan法進行數據差異顯著性分析。

2? 結果與分析

2.1? 荔枝果實發育時期的選取

依據李建國等[8]的劃分標準，發育Ⅰ期荔枝果實以果皮與種皮生長為主，還未長果肉;發育Ⅱa期的荔枝果實以胚快速生長為主，其他部分也有發育，至果肉逐漸包滿種子;發育Ⅱb期的荔枝果實指果肉已完全包裹種子至果實成熟。不同發育時期的果實注射農桿菌懸液后，雌花授粉后35 d左右的Ⅰ期和授粉后55 d左右的Ⅱa期果實均會停滯生長并落果;雌花授粉后70 d左右的部分Ⅱb期果實注射后會繼續生長發育一段時間，對農桿菌的耐受性明顯好于Ⅰ期和Ⅱa期，可進行取樣檢測，適用于本研究的瞬時表達研究。因此本實驗選取雌花授粉后70 d左右的Ⅱb期果實開展后續研究。另外，選取的果實成熟度不宜太高，因為實驗使用針頭較細的1 mL無菌注射器，果實成熟度越高則種子硬度越大，針頭難以刺入。

2.2? 農桿菌菌株的選擇

農桿菌懸液被注入荔枝果實后，會對果實造成傷害導致落果。注射菌株EHA105和GV3101后，統計坐果率分別為37.50%和54.17%，二者間無顯著差異（圖1）。對取樣的果實進行果肉部分GUS染色，EHA105和GV3101的染色率分別為20.83%和37.50%，二者間無顯著差異（圖2）。結果表明，雖然EHA105對果實的傷害可能高于GV3101，轉化率可能低于GV3101，但2種菌株不會對實驗效率產生顯著差異。最終，我們選擇農桿菌菌株GV3101開展以下荔枝果實注射瞬時轉化實驗。

2.3? 荔枝果實注射部位的選擇

本研究以果實的果柄、果皮、種子、果肉4個組織為目標進行注射，荔枝果實的結構特征（圖3）決定了種子和果肉部分的注射可同時進行，而果柄和果皮的注射要分別進行。注射農桿菌后觀察發現，果柄和果皮的注射口部位會結痂，但不影響果實正常發育。此外，果皮注射部位顏色在第5天左右會變紅（圖4），這可能是注射部位傷乙烯迅速增加促進果皮轉色的結果[9]。針對種子和果肉的研究，選擇分別從果蒂和果頂2個部位注入農桿菌懸液，進行對比實驗。結果發現，從果頂部位注射后，菌液會迅速聚集在注射口位置，有大量菌液溢出，果實內的菌液實際注入量少，且分布不均勻，菌液在果頂部位的局部富集導致果實易腐爛開裂。從果蒂部位注射后，少有菌液溢出，且果實完好。因此后續實驗均選擇從果蒂處注入果肉和種子。

2.4? 果實取樣時間的選擇

分別在注射后2、4、6、8 d取樣進行GUS染色檢測，分析發現：果柄、果皮、種子、果肉的GUS染色率均因取樣時間的不同而產生顯著差異。注射后2 d的果柄、果皮、種子、果肉4個組織經GUS染色后均可檢測到藍斑，但是GUS染色率分別只有37.50%、33.33%、8.33%、29.17%;注射后4 d的GUS染色率最高，分別是83.33%、45.83%、33.33%、37.50%;注射6 d后的部分果實表現出腐爛癥狀，各組織的GUS染色率也呈下降趨勢;注射8 d后雖可在極少數果實的果柄和種子部分檢測到藍斑，但是大多數果實的腐爛程度比較嚴重，不宜進行取果（圖5）。因此，注射后4 d是最佳的取樣時間。

不同字母表示同一組織在不同時間取樣的GUS染色率差異顯著（P<0.05）。

2.5? 菌液濃度的選擇

室外連體注射實驗中不同濃度的農桿菌懸液注射荔枝果實組織4 d后取樣進行GUS染色檢測，分析發現：果柄、果皮、種子、果肉的GUS染色率均因菌液濃度的不同而產生顯著差異。但果柄、果皮、種子、果肉的GUS染色率都以OD600值為2.4時最高，分別為54.17%、41.67%、29.17%、37.50%;其中果皮、種子、果肉的GUS染色率均隨著菌液濃度增大呈先上升后下降的趨勢。OD600值達到3.2的農桿菌注射果實后表現出腐爛加快且GUS染色率降低，農桿菌懸液OD600值為0.8時，果皮、種子、果肉3個結構轉化效率不理想（圖6）。綜上，OD600值為2.4的菌液濃度最佳。4種組織在注射OD600值為2.4的農桿菌GV3101重懸液4 d后進行GUS染色，均能顯色（圖7）。

不同字母表示同一組織在不同時間取樣的GUS染色率差異顯著（P<0.05）。

2.6? 連體注射和離體注射的對比

除了在田間開展連體注射，本研究還在室內進行了離體注射，結果表明，摘取的荔枝離體果實容易失水和褐變，而采取人工補水保濕方法，果實會發霉腐爛，影響取樣和檢測，可見離體實驗對果實的消毒等處理條件要求高。而且室內離體實驗中果柄、果皮、種子、果肉的GUS染色率較連體注射均不理想，其中注射的果柄部位在離體注射實驗中未能觀察到染色藍斑，染色率為0。由此可知，荔枝果實注射法宜采取連體注射。

3? 討論

在植物中開展基因的功能研究，可以借助傳統的轉基因技術，但前提是要有穩定、高效的離體再生技術體系。荔枝作為木本果樹，離體再生困難限制了傳統轉基因技術的應用。而且，前人以胚性愈傷組織為外植體，通過農桿菌介導或基因槍法建立起來的傳統轉基因技術體系均表現出周期長、轉化率低、穩定性差的缺點[10-12]，這嚴重制約了其應用于基因功能驗證的效率。因此，基因瞬時表達系統逐漸被開發，并被廣泛地應用于植物分子生物學研究[13]。其中，基因槍轟擊是常用的方法，常被用于在荔枝葉片、花、果皮等部位進行組織特異表達基因啟動子調控規律研究[14-16]。但是基因槍法對于荔枝果肉卻效果不理想，因為轟擊果肉，必須先破壞外層致密的果皮結構，從而導致果肉短期內就腐爛變質，無法開展后續研究。因此，需要尋找一種保持荔枝果實完整性的基因瞬時表達系統。Spolaore等[7]開發出一種針對成熟肉質果實的快速高效的農桿菌注射法，成功在蘋果、梨、番茄、桃、草莓、橙等果實細胞中開展了研究。借鑒Spolaore等人的研究經驗，本研究成功建立了適用于荔枝的果實注射法，為后期研究荔枝果肉特異表達基因及其啟動子功能奠定了基礎。

果實注射法是利用注射器將農桿菌懸浮液注入果實中，然后進行定性或定量分析的方法[7]。應用此方法首先要排除農桿菌自身造成的檢測干擾。例如，本研究選擇載體pCAMBIA1301中含有內含子的GUS基因作為報告基因，因為農桿菌等原核生物細胞在基因轉錄過程中沒有剪接內含子的能力，所以含有內含子的基因只能在真核生物細胞中表達而不能在原核生物細胞中表達[17]，從而避免農桿菌自身的GUS染色干擾。其次，由于農桿菌的注入會對果實產生有毒害的副作用，可能導致其生長停滯、腐爛等[18]，因此要盡量保持果實在好的生理狀態和適宜的條件下開展實驗，選擇對菌液耐受力較強的發育階段果實為材料，在合適的部位注入適宜濃度的農桿菌，在恰當的時機取果進行檢測，方可提高實驗成功率。本研究通過對比發現選擇雌花授粉后70 d左右的、果肉已完全包裹種子的Ⅱb期果實進行連體注射，在果柄、果皮、果蒂部位注入 OD600值為2.4的農桿菌GV3101，4 d后取果實進行檢測，GUS染色率較高，在果柄、果皮、種子、果肉均可見藍斑（圖7），且藍斑多出現在注射口附近，這可能與荔枝果實各組織結構致密，農桿菌懸液不易滲透擴散有關。

連體注射法最大限度保持了荔枝果實的完整性，直至檢測環節才會進行果實結構分離，而且該方法未改變果實生長發育所需的外部自然環境，因此可以真實、快速地反映果實的基因表達情況或啟動子調控規律，具有廣闊的荔枝分子生物學應用前景。

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