干旱脅迫下NaCl對棉花幼苗抗氧化酶活性及水分特征的影響

馮春曉，郝志軍，高健民，孫燕琳，柏新富

(1.魯東大學生命科學學院，山東 煙臺 264025； 2. 煙臺市出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000)

干旱是影響植物生長發育的主要環境脅迫因子之一。干旱條件下細胞中活性氧產生與清除之間的平衡失調，形成氧化脅迫[1-2]。植物經過長期進化形成了酶促和非酶促保護系統以清除活性氧，減輕或避免活性氧對細胞造成傷害[3-4]。氧化脅迫除能被干旱誘導外，還可被低溫、鹽漬、輻射、病毒、細菌等多種生物或非生物脅迫所誘導，是多種逆境的次級危害過程，抗性較強的品種一般都伴隨較高的抗氧化酶活性[5-6]。事實上多數情況下植物需要同時面對多種逆境因素，此時的核心防線可能就是抗氧化系統，這也許是多數抗氧化物質非特異性的進化原因。已有實驗表明，過表達SOD能提高植物對干旱、鹽漬等非生物脅迫的適應性[7-8]，即抗氧化酶系統活性的增強可提高植物的綜合抗性。

在干旱半干旱地區由于蒸發量遠大于降水量，再加上植物根系的吸水作用，導致近地表土壤溶液濃縮、鹽分濃度升高，植物根外鹽濃度升高建立起的Na+電化學勢梯度和植物細胞質膜內負外正的膜電勢，有利于Na+從外界環境到植物細胞內的被動運輸[9]，因此，干旱環境條件將誘使更多Na+被植物體吸收和積累。雖然Na+是造成植物鹽分脅迫的主要成分，但也有實驗證明Na+能促進植物的生長發育，有些植物更是把積累Na+作為適應干旱環境的有效策略之一[10-11]。本實驗室的研究也已證明低濃度的NaCl處理可以增加干旱條件下棉花幼苗的生物量[12]。不過，有關干旱條件下土壤NaCl對植物抗氧化系統調節的研究還少見報道。本研究以棉花為材料，測定不同濃度NaCl處理下抗氧化酶活性、總抗氧化力及MDA含量隨干旱程度的變化，探討干旱條件下土壤NaCl對棉花耐旱性的調節機制。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗于2017年3-6月在溫室內進行，供試材料為新農抗13號棉花(GossypiumhirsutumL.)。將種子播種于裝有混合土壤(園土∶細沙=1∶1)的花盆中(花盆口徑45 cm、高36.5 cm，每盆裝混合土26 kg)，適時澆水，確保土壤濕潤?；旌贤林械膱@土為棕壤土，前季作物為甘薯，土壤容重為0.95 g·cm-3，pH 7.2，電導率為0.78 ms·cm-1，有效氮、磷、鉀含量分別為73.36、32.63和50.25 mg·kg-1。植株長出2片真葉時間苗，每盆留5株長勢一致的幼苗。在苗齡40 d時將材料分成A、B、C、D、E五組(每組5盆)處理。處理時A、E兩組澆水，B、C、D三組分別澆濃度為50、100、200 mmol·L-1的NaCl溶液，澆水或NaCl溶液的量為每盆12 L，確保盆土中溶液被替換為相應濃度的處理液。隨后A、B、C、D組不再澆灌，進行自然干旱處理；E組每隔2 d澆水1 000 ml。最終形成的處理為：A，干旱+0 mmol·L-1NaCl(單一干旱) ；B，干旱+50 mmol·L-1NaCl；C，干旱+100 mmol·L-1NaCl；D,干旱+200 mmol·L-1NaCl；E,正常供水+0 mmol·L-1NaCl(對照)。在干旱處理期間每7 d取成熟度一致的葉片進行相關指標測定。

1.2 測定方法

1.2.1 酶活性測定 超氧化物歧化酶(SOD)活性和過氧化物酶(POD)活性測定參照孫群等[13]的方法；過氧化氫酶(CAT)活性測定采用郝建軍等[14]的方法。酶活性以單位質量鮮組織引起的變化量表示。

1.2.2 總抗氧化力的測定 利用南京建成生物工程研究所的總抗氧化力試劑盒測定。按說明書進行操作，樣品液0.1ml 分別加入試劑Ⅰ1.0 ml、試劑Ⅱ2.0 ml和試劑Ⅲ 0.5 ml，混勻，37℃水浴30 min(反應時間)，再加試劑Ⅳ 0.1 ml，混勻、放置10 min后520 nm測吸光度值(OD值)。以單位質量鮮組織反應每分鐘OD值變化0.01為1個活力單位。

1.2.3 丙二醛(MDA)含量測定 采用趙世杰[15]的方法。

1.2.4 土壤、葉片相對含水量(RWC)測定 用烘干稱重法，RWC(%)=[(鮮重-干重)/(飽和鮮重-干重)] ×100%。

1.2.5 植株水勢、滲透勢和細胞膨壓的測定 植株水勢用壓力室法測定；葉片滲透勢采用露點微伏壓計(HR-33T, 美國)測定，葉片先在-18℃冰箱冷凍12 h以上，取出解凍至室溫后擠壓出組織液測定；細胞膨壓由“水勢-滲透勢”計算得出。

1.2.6 葉片Na+含量測定 葉片Na+的提取參照王寶山等[16]的方法，提取液中Na+含量用原子吸收分光光度計(GBC-932B型，澳大利亞)測定。

1.3 數據處理

所有測定均重復5次，結果以“平均值±標準差”計。用Origin軟件作圖、SPSS 17.0統計軟件進行數據處理和差異性分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理下棉花幼苗葉片SOD、POD和CAT活性變化

從圖1可看出，對照植株葉片SOD活性相對穩定；干旱處理后的前21 d，各處理植株葉片SOD活性顯著升高(前7 d升高較慢，可能與此時土壤和植株的水分含量較高有關)；21 d后處理A(單一干旱)植株葉片SOD活性急劇下降，處理B植株葉片SOD活性小幅下降，而處理C和D植株葉片SOD活性沒有出現下降現象。POD活性隨著干旱持續時間的延長，各處理(對照除外)均有逐漸增強的趨勢(圖1)。在干旱處理開始的前7d，處理B、C、D植株葉片POD活性略高于A、E。隨后處理A植株葉片POD活性快速升高，且明顯高于其它各組(圖1)。各處理棉花葉片CAT活性隨干旱處理時間的變化趨勢與SOD類似，處理A植株葉片CAT活性先升后降，其它各處理的植株葉片CAT活性沒有大幅變化。

注：A，干旱+0 mmol·L-1 NaCl；B，干旱+50 mmol·L-1 NaCl；C，干旱+100 mmol·L-1 NaCl；D，干旱+200 mmol·L-1 NaCl；E，不干旱+0 mmol·L-1 NaCl (對照)。下同。Note: A，Drought+0 mmol·L-1 NaCl; B，Drought+50 mmol·L-1 NaCl; C，Drought+100 mmol·L-1 NaCl; D，Drought+200 mmol·L-1 NaCl; E，Control. The same as below. 圖1 不同處理棉花葉片SOD、POD和CAT活性隨干旱持續時間的變化Fig.1 Variations of SOD, POD, and CAT activities in cotton leaves under different salt treatments with drought duration

2.2 不同處理下棉花幼苗葉片總抗氧化力的變化

圖2 不同處理棉花葉片總抗氧化力隨干旱持續時間的變化Fig.2 Variations in total antioxidative capacity in cotton leavesunder different salt treatments with drought duration

總抗氧化能力(T-AOC )是體內所有抗氧化酶和抗氧化物質抗氧化能力的總和，是衡量機體抗氧化系統功能狀況的綜合性指標[17]。本試驗結果顯示(圖2)，處理A(單一干旱)植株葉片總抗氧化力在干旱處理后的前7 d基本沒有變化，隨后迅速升高，至第21 d達到最高值，明顯高于其它各處理，隨后又快速下降。處理B、C、D的植株葉片總抗氧化力在干旱處理后的前7 d略高于A，隨干旱持續時間延長逐漸升高，但變化速度明顯低于處理A。處理E由于沒有受到脅迫，總抗氧化力變化幅度較小。

2.3 不同處理下棉花幼苗葉片MDA含量的變化

MDA是脂質過氧化的產物，其含量表明植物體受活性氧破壞的程度，MDA積累越多，表明植物細胞受傷害程度越大[18-19]。圖3顯示，棉花葉片中MDA含量隨干旱時間的延長均呈增加趨勢，且處理A(單一干旱)的植株葉片MDA含量顯著高于其它各處理，至干旱處理21d后其含量約為處理B、C、D植株葉片MDA含量的1.5倍。處理E(對照)沒有明顯變化。

2.4 各處理土壤和植株水分狀況及組織Na+含量的比較

圖4顯示，土壤RWC除對照組因澆水而保持較高外，各處理均隨干旱時間的延長而持續下降，但處理B、C、D的土壤RWC下降幅度明顯小于處理A(單一干旱)；葉片RWC的變化只是在干旱處理的前7 d，因土壤水分較充足，各處理葉片RWC變化均較小，隨后變化趨勢與土壤相似。說明土壤鹽分的存在既可增強土壤的保水能力，也有利于植株水分的保持。在外觀形態上，干旱處理后第28 d，處理A棉花葉片出現嚴重萎蔫，而處理B僅輕度萎蔫、處理C和D沒有出現明顯萎蔫現象。對植株水分狀況及組織Na+含量等的測定結果顯示(表1)，干旱處理導致了植株水勢和滲透勢的極顯著降低(P<0.01)；同樣干旱條件下，隨著土壤鹽處理濃度的增加，植株水勢和滲透勢也顯著降低(P<0.05), 也就是說干旱和土壤鹽漬均可導致植株水勢和滲透勢的顯著下降。然而，處理B、C、D植株雖然水勢顯著低于處理A(單一干旱)，但由于組織內積累了較多Na+，使葉片滲透勢較處理A降低了17.5%～40.1%(組織滲透勢與Na+含量的對數呈極顯著負相關，y=-0.54ln(x)-1.84，相關系數r=0.996)，從而使其細胞膨壓極顯著高于處理A(P<0.01)。

圖3 不同處理棉花葉片MDA含量隨干旱處理時間的變化Fig.3 Variations of MDA content in cotton leaves underdifferent salt treatments with drought duration

3 討 論

干旱等逆境脅迫下細胞內產生過剩的活性氧自由基，造成細胞膜系統損傷和透性增加，影響植物代謝[20]；同時，活性氧也可作為第二信使介導逆境脅迫下植物體內的信號轉導，調節抗氧化酶等相關基因表達及酶活性的上升，從而提高植物的耐逆性[21-22]。SOD、POD和CAT是植物體內重要的抗氧化酶，已有大量研究證明植物的抗旱能力和受傷害程度與這3種酶的活性密切相關。李廣敏等[23]對不同抗旱性玉米品種保護酶系統的研究表明，輕度、中度脅迫下SOD、CAT、POD活性隨脅迫程度的增加而升高；重度脅迫下SOD、CAT活性降低，而POD活性繼續增高。李國龍等[24]、杜彩艷等[25]、井瑾等[26]和Wang等[27]研究顯示，隨干旱脅迫強度增加多種植物的 SOD、POD、CAT活性均呈現先升高后降低的變化趨勢。由此可見，SOD、POD、CAT活性隨干旱脅迫強度的增大而升高，當脅迫強度超出植物能夠承受的程度后，SOD、CAT活性出現降低，POD活性則因植物種類不同而表現出差異。本試驗盆栽棉花幼苗用0、50、100、200 mmol·L-1NaCl溶液灌透后停止澆水，進行自然干旱處理。隨干旱時間的延長，處理A(單一干旱)棉花葉片SOD、POD、CAT活性顯著增加，在干旱處理后期，SOD和CAT活性又大幅度下降，這與已有的研究結果相似。而處理B、C、D (50、100、200 mmol·L-1NaCl溶液澆灌)棉花葉片SOD、POD、CAT活性變化幅度均明顯小于處理A。另外，從外觀形態上看，干旱處理后第28 d，處理A的棉花葉片表現出嚴重萎蔫，而處理B的僅輕度萎蔫，處理C和D的沒有表現出明顯萎蔫現象?？梢哉J為，本試驗中單一干旱處理的棉花幼苗在干旱期間SOD、POD、CAT活性的大幅升高和降低是干旱脅迫導致的嚴重細胞傷害的結果；而50～200 mmol·L-1NaCl溶液澆灌的棉花幼苗在干旱期間3種酶活性的升高和降低幅度較小，說明NaCl溶液澆灌土壤減弱了干旱脅迫對其的傷害程度。本試驗中對總抗氧化力(T-AOC)和MDA含量的測定結果也證明了這一點。對各處理土壤和植株水分狀況的分析發現，土壤加入適量鹽分后顯著提高了其保水能力，同時由于植株對Na+的吸收和積累，降低了葉片滲透勢，從而維持了較強的吸水、保水能力和較高的細胞膨壓，而細胞膨壓的維持對正常生命活動的進行具有重要意義[28]。可見，土壤中適量鹽分存在能夠增加棉花對Na+的吸收和積累、降低組織滲透勢、維持較強的吸水保水力，從而減弱因干旱脫水導致的過量活性氧自由基產生對植株的傷害，增強其耐旱性能。

圖4 土壤和葉片相對含水量隨干旱持續時間的變化Fig.4 Variations of RWC in soil and leaves under different salt treatments with drought duration

處理TreatmentNaCl/(mmol·L-1)葉片水勢/MPaWater potential in leaves葉片滲透勢/MPaOsmotic potential in leaves細胞膨壓/MPaCell turgor葉片Na+含量/(mg·g-1)Na+ content in leaves A0-2.33±0.03 bB-2.17±0.04B-0.16±0.01eD1.90±0.21aAB50-2.52±0.02 cC-2.55±0.02C0.03±0.01dC3.64±0.26bBC100-2.67±0.027dC-2.84±0.01D0.17±0.02cB5.79±0.42cCD200-2.91±0.026eD-3.04±0.01E0.13±0.02bB9.56±0.39dDE0-1.41±0.035aA-1.75±0.01A0.34±0.03aA1.79±0.15aA

注：數據后字母相同表示無顯著差異(P>0.05)，小寫字母和大寫字母不同分別表示在5%或1%水平上差異顯著。

Note：The same letter within the same column indicates non-significant difference (P>0.05), the lowercase and capital letters indicate 5% and 1% level of significance, respectively.

植物對非生物脅迫的適應是一個復雜的過程，干旱和鹽分組合條件下棉花適應干旱能力的增強，這其中有抗逆交叉適應的因素，但土壤鹽分存在導致其離子積累的增加，有利于降低組織滲透勢、增強吸水動力；積累離子參與滲透調節還可減少干旱條件下有機滲透調節物質合成所需的物質和能量消耗，這對植物的水分代謝和同化物積累可能是有益的。當然，根據已有研究結果，棉花萌發和生長的極限土壤含鹽量約為0.4%～0.6%[29]，有關棉花鹽脅迫研究設定的NaCl濃度多為100～200 mmol·L-1NaCl[30-31]，也有400 mmol·L-1NaCl[32]，本試驗設定的最高200 mmol·L-1NaCl濃度，對棉花而言屬于輕度到中度的鹽脅迫，如果NaCl濃度過高再疊加上干旱無疑會對棉花造成傷害。有關棉花在利用鹽離子作為滲透調節物質和避免鹽漬化傷害之間如何平衡、以及不同植物在不同干旱程度下對其不會產生明顯傷害且有益于其滲透調節的土壤鹽分閾值是多少等問題還需進一步的試驗研究。

4 結 論

1)與對照相比，單一干旱處理的棉花幼苗SOD、CAT活性和總抗氧化力在處理后的前21d大幅升高隨后又快速下降，POD活性則持續升高，而干旱與50～200 mmol·L-1NaCl組合處理的棉花幼苗的抗氧化酶活性和總抗氧化力的變幅明顯小于單一干旱處理的。

2)單一干旱處理的棉花幼苗葉片的MDA含量明顯高于干旱與50～200 mmol·L-1NaCl組合處理的。

3)干旱與50～200 mmol·L-1NaCl組合處理的棉花幼苗的葉片相對含水量、細胞膨壓和Na+含量顯著高于單一干旱處理的，滲透勢則顯著低于后者。

4)上述結果說明，干旱條件下，輕度鹽脅迫可以增加棉花植株對Na+的吸收和積累、降低滲透勢，從而有利于維持水分平衡、緩解干旱脅迫對棉花幼苗的不利影響。