硝普鈉(SNP)浸種對滲透脅迫下不同紫花苜蓿種子萌發生理特性的影響

趙 穎，魏小紅，馬文靜，駱巧娟，宿梅飛

(甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是我國西北地區廣泛種植的優質豆科牧草，具有廣泛的生態適應性，被譽為“牧草之王”[1]，對我國畜牧業的可持續發展起到重要作用[2-3]。盡管紫花苜蓿對水分適應性強，但在種子萌發期干旱會抑制其萌發[4]，進而對生長發育后期的生物量造成嚴重的影響。因此，探討紫花苜蓿種子萌發過程中的適應機制顯得至關重要。

NO是一種重要的信號分子，可以緩解非生物脅迫下植物體內ROS的積累，減少各種脅迫造成的氧化損傷，從而增強植物的適應能力[5]；同時還可以促進種子萌發、下胚軸伸長[6]，影響植物組織的生長[7]，并參與調節干旱脅迫、鹽害及抗病能力[8]，對植物的生長發育具有重要影響。在植物體內NO主要通過一氧化氮合酶(NOS，EC1.6.6.1/2)和硝酸還原酶(NR，EC1.6.61/2)催化形成[9-10]，內源NO的產生受植物物種、組織、細胞類型及環境條件等多種因素影響[11]。硝普鈉(SNP)是一種重要的NO供體，Delledonne等[12]報告0.5 mmol·L-1SNP釋放約2.0 μmol·L-1NO。增施外源NO可提高內源NO水平，有關研究表明外源NO對細胞凋亡、激素調控、光合作用和各種脅迫響應等許多重要生理過程具有調節作用[13-15]，同時還可以誘導抗氧化活性，增加相關基因的轉錄本[16]。

植物的抗逆能力隨個體發育階段不同而發生變化[17]，種子萌發期往往是對逆境脅迫十分敏感的時期[18]，這一時期的特性決定了該植物在某一地區是否能夠成功建苗。有關苜蓿生態適應性的研究和報道已有很多，研究方向也逐漸從形態水平過渡到生理生化及分子水平[19-22]。研究表明植物脅迫耐受性幅度與內源性NO的水平呈正相關，抗性強的品種PEG脅迫后NO產生量較大，而抗旱敏感型相反[23]。目前，滲透脅迫下外源NO對不同品種紫花苜蓿萌發期的影響還未見報道。本研究以紫花苜蓿品種阿爾岡金、金皇后和三得利為材料，研究外源NO對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發過程中滲透調節物質、抗氧化酶活性的變化規律，探討干旱脅迫下NO對苜蓿種子萌發的調控機制，以期為干旱地區紫花苜蓿的選種栽培、應用化學途徑提高耐旱性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

供試材料為紫花苜蓿，分別為品種A：阿爾崗金，品種B：金皇后，品種C：三得利，購于甘肅省農業科學院。

試驗選取均勻飽滿的苜蓿種子，用20% NaClO溶液消毒10 min，去離子水沖洗5次，分別用去離子水和0.1 mmol·L-1SNP溶液在黑暗條件下浸泡48 h。將預處理后的種子置于墊有雙層濾紙的培養皿(φ=9 cm)中，每皿50粒種子，每處理重復三次，2 d后進行干旱脅迫，共設置以下4個處理：蒸餾水為空白對照(CK)；0.1 mmol·L-1SNP(SNP)；10% PEG-6000 (PEG)；0.1 mmol·L-1SNP+10% PEG-6000 (SNP+PEG)。按試驗設計每天10∶00更換4 mL處理液以確保濃度一致。所有培養皿培養條件為：(25±1)℃；80%相對濕度；光照/黑暗：12 h/12 h；光照強度400 μmol·m-2·s-1。分別在處理的0、2、4、6 d測定相關生理指標。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 丙二醛(MDA)含量 采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定[24]。

1.2.2 滲透調節物質 脯氨酸(Pro)含量采用酸性水合茚三酮法[25]，可溶性糖含量采用蒽酮比色法[24],可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250法[26]測定。

1.2.3 抗氧化酶的活性 超氧化物歧化酶(SOD)活性參照Liu等[27]的方法測定；過氧化物酶(POD)活性參照Shi等[28]的方法測定；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性參照Nakano和Asada[29]的方法測定；過氧化氫酶(CAT)活性參照Aebi[30]的方法測定。

1.3 數據分析

試驗數據采用Microsoft Excel 2010進行處理及作圖，用SPSS 19.0軟件Duncan法進行統計學分析，數據顯示均為“平均值±SE”表示，字母不同表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 SNP溶液浸種對PEG脅迫下紫花苜蓿種子MDA含量的影響

如圖1所示，PEG脅迫下3個品種紫花苜蓿種子中MDA含量隨著脅迫時間的延長均逐漸升高，SNP+PEG能有效抑制MDA的增加。在第6 d時，C品種MDA含量有最大值14.35 μmol·g-1，是品種A和B的1.32倍，與PEG處理相比，SNP+PEG處理下A、B、C品種MDA含量分別下降了23.11%，21.81%和30.38%。由此可見，滲透脅迫下品種C中MDA積累量最大，抵御滲透脅迫能力較弱，但SNP浸種對其氧化損傷的緩解作用最強。

2.2 SNP溶液浸種對PEG脅迫下紫花苜蓿種子滲透調節物質含量的影響

由表1可知，0 d時各處理之間脯氨酸含量無顯著差異，隨PEG脅迫時間的延長，3品種紫花苜蓿種子萌發過程中脯氨酸含量先增后降。處理第4 d時，脯氨酸含量達到最大值，A、B和C含量分別為460.95，262.68 μg·g-1和277.18 μg·g-1，SNP+PEG比PEG處理A、B、C品種脯氨酸分別增加了13.71%、16.46% 和 17.87%。

從表1可知，與CK相比，PEG脅迫下可溶性糖含量降低，紫花苜蓿種子萌發過程中可溶性糖含量呈先增后降的變化趨勢。SNP浸種提高了紫花苜蓿種子中可溶性糖含量。處理第2 d時，品種A可溶性糖含量最高，為27.48 mg·g-1，分別是品種B和C的4.82倍和2.42倍，SNP+PEG與PEG處理相比，A、B、C品種可溶性糖含量分別增加了15.78%、16.84%和17.52%。處理第6 d時，SNP+PEG比PEG處理使A、B、C 3個品種可溶性糖含量分別提高了40.24%、20.34%和14.24%。

可溶性蛋白含量的變化與可溶性糖相似。由表1可知，各品種紫花苜蓿種子萌發過程中可溶性蛋白含量呈先增后降趨勢，金皇后與三得利在第2 d達到最大值，阿爾崗金在第4 d達到最大值。PEG脅迫比CK可溶性蛋白含量顯著降低，在第2，4，6 d的下降幅度均為品種A>品種B>品種C。SNP+PEG與PEG處理相比顯著增加了可溶性蛋白的含量，且在第6 d增加量最大，A、B、C品種可溶性蛋白含量在SNP+PEG處理下分別是PEG處理下的2.25、1.31、1.16倍。

2.3 SNP溶液浸種對PEG脅迫下紫花苜蓿種子抗氧化酶活性的影響

2.3.1 SOD活性 如圖2所示，苜蓿種子萌發期SOD活性隨干旱脅迫時間的延長呈先增后降趨勢，且在處理第4 d活性最大。SNP處理下苜蓿種子萌發過程中SOD活性最大，SNP+PEG比PEG處理顯著提高了SOD活性。在處理第4 d，A、B、C品種SNP+PEG比PEG處理SOD活性分別顯著提高了12.84%、8.65%和35.49%，說明品種C中 SOD活性受外源NO影響較大。

2.3.2 POD活性 如圖3所示，苜蓿種子POD活性變化趨勢與SOD活性相似，呈先升后降趨勢且于處理第4 d達到最大值。與CK相比，PEG處理使POD活性降低，施加外源NO緩解了該抑制作用。處理第4 d，A、B、C品種POD活性分別較CK增加了53.99%，54.24%和65.56%，說明SNP對POD活性調控作用較大。

2.3.3 CAT活性 如圖4所示，CAT活性隨著發芽時間的延長逐漸升高，在處理第4 d達到最大值。品種A在第2 d和6 d時處理間無差異，在處理第4 d，SNP+PEG處理與CK相比無顯著差異，但較PEG處理CAT活性提高了17.31%。品種B在處理第2 d和第4 d SNP+PEG與SNP處理CAT活性差異不顯著，與PEG處理相比分別提高了19.96%和17.35%。品種C在處理第4 d和第6 d SNP+PEG比PEG處理CAT活性提高了12.80%和40.86%。

注：同一處理時間不同字母表示差異顯著(P<0.05),下同。Note：The different letters in the same treatment time group mean significant difference at P<0.05，the same below.圖1 SNP溶液浸種對PEG脅迫下紫花苜蓿種子萌發過程中MDA含量的影響Fig.1 Effects of SNP acid on MDA contents during seed germination of alfalfa under PEG stress

圖2 SNP溶液浸種對PEG脅迫下紫花苜蓿種子萌發過程中SOD活性的影響Fig.2 Effects of SNP acid on SOD activity during seed germination of alfalfa under PEG stress

圖3 SNP溶液浸種對PEG脅迫下紫花苜蓿種子萌發過程中POD活性的影響Fig.3 Effects of SNP acid on POD activity during seed germination of alfalfa under PEG stress

2.3.4 APX活性 由圖5可知，紫花苜蓿種子萌發過程中APX活性呈先增高后降低的變化趨勢，CK除外，SNP+PEG處理APX活性最高。在處理第2 d，品種A中APX活性在SNP、PEG、SNP+PEG處理下是CK的1.58、2.16倍和2.33倍，處理第4 d，SNP+PEG較PEG處理APX活性提高了37.72%。品種B在處理第4 d SNP+PEG比PEG處理APX活性提高了47.09%。品種C在處理第4 d SNP與PEG處理間差異不顯著，SNP+PEG比PEG處理APX活性提高了34.87%。

2.4 不同處理及不同PEG脅迫時間對3個品種紫花苜蓿抗性的影響

通過對各品種紫花苜蓿不同處理、不同PEG脅迫時間下各生理指標進行多因素方差分析可知，在紫花苜蓿種子萌發過程中經SNP處理后，3個苜蓿品種中可溶性糖、可溶性蛋白含量及SOD、POD、CAT活性最高。SNP+PEG較SNP處理，可溶性蛋白含量、SOD、POD、CAT活性均顯著下降；MDA含量變化表現為：阿爾崗金和三得利品種為PEG>SNP+PEG>SNP，且差異顯著；而金皇后品種表現為PEG處理時MDA含量最高，施加外源NO緩解了MDA積累。阿爾崗金與金皇后中脯氨酸含量各處理間差異顯著，而三得利中脯氨酸含量與前兩種含量變化趨勢相同。APX酶活性在SNP+PEG處理下最高。通過以上分析可知，施加外源NO能夠顯著提高干旱脅迫下紫花苜蓿種子抗氧化酶活性，緩解膜脂過氧化，提高種子的抗旱性。

圖5 SNP溶液浸種對PEG脅迫下紫花苜蓿種子萌發過程中APX活性的影響Fig.5 Effects of SNP acid on APX activity during seed germination of alfalfa under PEG stress

品種Variety生理指標Physiologicalindex處理 TreatmentCKSNPPEGSNP+PEG時間 Time/d246阿爾崗金AlgonquinMDA含量 MDA content3.02c3.70c5.65a4.64b2.21c5.96b7.95a脯氨酸含量 Proline content146.06d186.95c222.45b347.74a267.34a287.06a267.71a可溶性糖含量 Soluble sugar content17.41b20.01a11.11d12.40c22.10a19.11b12.85c可溶性蛋白含量 Soluble protein content35.03b40.09a24.21c34.06b29.10b54.83a25.43bSOD活性 SOD activity104.58d147.32a121.57c134.79b165.00a168.17a87.40bPOD活性 POD activity143.44c210.89a118.21d169.54b138.25c221.67a161.68bCAT活性 CAT activity21.18b24.05a19.30c21.99b25.86b30.60a17.57cAPX活性 APX activity1.39d2.01c2.50b3.42a2.65b3.24a2.19b金皇后GoldenempressMDA含量 MDA content3.11c4.83b7.04a5.52b3.33b6.9a7.74a脯氨酸含量 Proline content140.47d154.98c176.05b198.99a194.23a204.43a169.80b可溶性糖含量 Soluble sugar content3.20b4.56a2.30d2.64c4.03a3.29b3.17b可溶性蛋白含量 Soluble protein content46.95ab49.14a39.88c44.53b60.21a49.61b34.74cSOD活性 SOD activity137.37d157.95a140.72c148.10b165.07b191.05a105.44cPOD活性 POD activity187.73c264.06a160.54d217.58b220.49b262.67a224.89bCAT活性 CAT activity39.66b51.02a38.36b49.07a52.82b59.55a35.81cAPX活性 APX activity1.53c1.99b2.08b3.41a2.16c3.04a2.40b三得利SanditiMDA含量 MDA content3.96c4.40c7.95a5.58b3.81c6.37b9.61a脯氨酸含量 Proline content138.46c150.44c177.26b203.35a169.12b212.33a185.26b可溶性糖含量 Soluble sugar content4.91b6.39a3.76d4.22bc7.85a4.84b4.13b可溶性蛋白含量 Soluble protein content48.57b52.60a41.75c46.99b57.98a53.87b34.25cSOD活性 SOD activity120.31b140.29a106.70c133.99a84.57c153.79b172.13aPOD活性 POD activity148.47c215.24a119.27d184.51b171.23b213.87a156.91bCAT活性 CAT activity28.16d43.63a31.37c39.33b35.41b48.37a32.49bAPX活性 APX activity1.28c2.05b2.13b2.77a2.18b3.22a1.68c

對處理時間進行多因素方差分析可知，3品種紫花苜蓿種子SOD、POD、CAT和APX酶活性均在第4 d時最強，而三得利種子SOD活性在萌發的第6 d表現最強；MDA含量隨著干旱脅迫時間增加而逐漸增大，不同時間點差異顯著，三得利品種MDA含量最大。脯氨酸含量變化表現為：3個品種都在第4 d時有最大值，但阿爾崗金在各時間點無差異顯著性。金皇后和三得利品種在可溶性糖和可溶性蛋白含量上差異顯著性表現相同，在處理第2 d值最大。

3 討 論

本試驗研究外源NO對干旱脅迫下不同紫花苜蓿的調控及其與抗性的關系。結果表明，0.1 mmol·L-1SNP浸種可明顯降低干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發過程中MDA的含量，且隨著干旱脅迫時間的增加MDA含量增大，各處理MDA含量差異增大。三得利品種MDA含量最大，說明其抗旱性最弱，阿爾崗金抗旱性最強，這與穆懷彬等[31]的研究一致。在萌發的第4 d三個品種各處理間均差異顯著，滲透脅迫下施加SNP對三得利MDA含量緩解作用最強。綜上所述，三得利比其他兩個品種能更加敏感地感知外源NO。脯氨酸的積累是植物對逆境脅迫的一種重要保護機制，能夠清除ROS并提高抗氧化能力[32]。劉文瑜等[5]研究表明鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發過程中脯氨酸含量顯著上升，不同濃度SNP處理能夠緩解鹽脅迫對種子的傷害，提高脯氨酸含量，其中以0.1 mmol·L-1SNP緩解效果最佳。本試驗0.1 mmol·L-1SNP能顯著緩解干旱脅迫下紫花苜蓿萌發過程中的氧化損傷，干旱脅迫下阿爾崗金品種脯氨酸含量最多，金皇后次之，三得利最少，但PEG脅迫下施加SNP后脯氨酸含量的提高率相反。這說明阿爾崗金自身滲透調節能力較強，能夠很好地抵御外界環境傷害。三得利自身調節能力弱于阿爾崗金，但其滲透調節物質受外源SNP影響較大，此結果與MDA含量變化相一致。

種子萌發的過程需要大量的能量維持其生命活動[33]，種子的營養成分主要包括糖類、脂肪和蛋白質，當種子發芽時這些貯藏物質轉化為小分子物質，為胚的生長發育提供所必須的養料和能量[34-36]。本試驗中可溶性糖和可溶性蛋白含量呈先增后降趨勢，反映了種子萌發過程中消耗能量的過程，不同品種紫花苜蓿萌發過程中可溶性糖和可溶性蛋白所占比例不同，阿爾崗金種子可溶性糖含量是另兩個品種的3～4倍，可能與種子自身營養物質組成有關，但可溶性蛋白含量相比較低，這說明種子萌發過程中先消耗糖類物質，能量不足時才會消耗蛋白質。可溶性糖和可溶性蛋白作為滲透調節物質其含量變化在一定程度上反映了植物體內代謝變化情況，逆境脅迫下可溶性糖和可溶性蛋白含量的增加有利于植物抵御脅迫造成的傷害。干旱脅迫下施加SNP后，阿爾崗金可溶性蛋白含量增加的最多，可溶性糖含量增幅少；金皇后品種可溶性蛋白含量增幅少，但可溶性糖含量增幅最多；三得利品種的變化均介于其它兩個品種之間。說明SNP調節種子萌發過程中抵御逆境的能力受品種自身營養成分構成的影響。

綜上所述，紫花苜蓿種子的萌發過程MDA、Pro、可溶性糖和蛋白質、抗氧化酶的變化證明了種子萌發的系統性。SNP浸種能夠在一定程度上拮抗PEG，減少逆境傷害，但不同品種紫花苜蓿對SNP的敏感性存在一定的差異。SNP對種子萌發過程的影響是一個復雜的體系，單一指標很難說明某個品種對NO信號的敏感性，對此本研究綜合多個與抗旱性密切相關的指標做多因素方差分析，結果表明阿爾崗金抗旱性最強，但其對外源NO的響應能力最弱，三得利品種抗旱性最弱，其對NO的感知敏感性最強。推測這是因為不同品種對干旱作出應答的靈敏度和準確性不同，而植物細胞中內源NO的產生水平也會干擾外源NO信號的傳遞。本研究初步確定外源NO對紫花苜蓿萌發期抗性的調控作用與品種自身特性有關,但各品種在不同生育階段對某一具體指標的耐性反應不一定相同，今后可對各品種不同生育期外源NO的調控機理進行研究和探討, 為旱區紫花苜蓿栽培提供理論依據。