新疆阿魏內生菌Alternaria sp.TA26-16 化學成分的研究

蔣瑞娟， 宋 駿， 何 權， 徐建國， 朱 軍， 斯建勇， 李曉瑾*

（1.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，國家中醫藥管理局新疆中藥民族藥資源重點實驗室，新疆烏魯木齊830002；2.新疆農業大學農學院，新疆 烏魯木齊830052；3.中國醫學科學院 北京協和醫學院藥用植物研究所，中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京100193）

植物內生真菌是指在生活史的某一階段或全部階段生活在健康植物組織內又不對植物組織造成明顯病害癥狀的菌株。它不僅可以促進植物生長，提高植物有效成分含有量，優化生態環境，還可以產生一些與宿主植物相似或相同的生物活性成分，因此極具新藥開發前景［1-2］。

新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen 是傘形科阿魏屬植物［3］，全國僅在新疆伊犁地區有少量分布［4］，樹脂為其藥用部位，具有消積、化癥、散痞、殺蟲等作用［5］。由于生長環境惡劣、花后結實即死等生理缺陷以及采膠方式錯誤、過度放牧等人為因素，新疆阿魏已被《中國珍稀瀕危保護植物名錄》 納入三級重點保護瀕危植物。利用現代技術手段，研究瀕危藥用植物內生真菌的化學成分對于緩解瀕危植物壓力、保護生態環境具有重大意義。

目前，課題組從新疆阿魏中分離得到內生菌337 株，經過篩選，內生菌株Alternaria.sp.TA26-16 具有較好的抗腫瘤活性。本研究對新疆阿魏內生菌株Alternaria sp.TA26-16 固體發酵產物的甲醇提取物進行化學成分研究，從中分離得到10個化合物，且所有化合物均為首次從該菌中分離得到。

1 材料

Bruker AV Ⅲ600 核磁共振波譜儀 （德國Bruker 公司）；EYEL4 旋轉蒸發儀（廣州愛浪儀器設備有限公司）；SA-1500-1 超凈工作臺（上海上凈凈化設備有限公司）；柱層層析硅膠（青島海洋化工廠）；薄層色譜硅膠板GF254（煙臺市化學工業研究所）。

內生真菌分離自新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen，由中國醫學科學院藥用植物研究所陳娟研究員鑒定為Alternaria sp.TA26-16，菌種保藏于新疆中藥民族藥研究所微生物實驗室， 編號6626。

土豆培養基，土豆去皮，切成約2 cm3的小塊，加1 000 mL 蒸餾水煮沸20 min，玻棒攪拌，雙層紗布過濾，取濾液加20 g 葡萄糖、16 g 瓊脂，補足濾液至1 000 mL，自然pH。

大米培養基，取60 g 大米放于錐形瓶中，倒入80 mL 蒸餾水，自然pH，高壓滅菌20 min。

菌株發酵產物，菌株Alternaria sp.TA26-16 接種于土豆培養基25 ℃下培養5 d，再接種至大米培養基上25 ℃恒溫發酵培養30 d。

2 提取與分離

用等量甲醇萃取菌株發酵產物3 次， 每次24 h，得甲醇提取物42 g，再用300 g 硅藻土拌樣，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯洗脫，分別得相應部位10.6、9.4、8.7 g。

石油醚部位經硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫（100 ∶1 ～1 ∶1），得14 個組分（Fr.2-1～14），Fr.2-3 經硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯（20 ∶1～1 ∶1） 梯度洗脫，得化合物1（6.4 mg）、2（7.9 mg）。取餾分Fr.2-7 凝膠柱分離，甲醇洗脫，得化合物3（5.3 mg）。取餾分Fr.2-14 硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯（20 ∶1） 洗脫，得化合物4（6.2 mg）。

二氯甲烷部位經硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫 （100 ∶0 ～0 ∶100）， 得17 個組分（Fr.3-1～17），Fr.3-3 經硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯（60 ∶40） 洗脫，得化合物5（9.2 mg）、6（7.4 mg）。 Fr.3-15 經硅膠柱分離， 氯仿-甲醇（30 ∶1） 洗脫得化合物7（6.3 mg）。

乙酸乙酯部位經硅膠柱分離，氯仿-甲醇梯度洗脫（100 ∶0～0 ∶100），最后用甲醇洗脫。得19個組分（Fr.4-1 ～19），Fr.4-5 經硅膠柱分離，氯仿-甲醇（20 ∶1 ～0 ∶1） 梯度洗脫，得化合物8（6.1 mg）。 Fr.3-15 經硅膠柱分離， 氯仿-甲醇（30 ∶1） 洗脫，得化合物9（10.8 mg）。Fr.4-13利用半制備液相分離，甲醇-水（75 ∶25），得化合物10（6.5 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：淡黃色針晶（甲醇）。ESI-MS m／z：415［M ＋Na］＋。1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δ：6.03（1H，d，J ＝9.4 Hz，H-6），5.73（1H，s，H-4），5.26（1H，dd，J ＝8.0，15.2 Hz，H-23），5.20（1H，dd，J ＝8.0，15.2 Hz，H-22），1.05（3H，d，J ＝6.6 Hz，H-21），0.99（3H，s，H-19），0.95（3H，s，H-18），0.93（3H，d，J ＝6.89 Hz，H-28），0.84（3H，d，J ＝7.1 Hz，H-27），0.82（3H，d，J ＝8.1 Hz，H-26）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3） δ：34.3（C-1），34.4（C-2），199.7（C-3），123.1（C-4），164.6（C-5），124.6（C-6），134.2（C-7），124.6（C-8），44.4（C-9），36.9（C-10），19.1（C-11），35.7（C-12），44.1（C-13），156.3（C-14），25.5（C-15），27.9（C-16），55.8（C-17），19.1（C-18），16.8（C-19），39.4（C-20），21.4（C-21），135.1（C-22），132.7（C-23），43.0（C-24），33.2（C-25），19.8（C-26），20.1（C-27），17.8（C-28）。以上數據與文獻［6］ 基本一致，故鑒定為麥角甾-4，6，8（14），22E-四烯-3-酮。

化合 物2： 無 色 油 狀 物。 ESI-MS m／z： 301［M＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CDCl3） δ：7.96（2H，m，H-3，6），7.77（2H，m，H-4，5），4.56（4H，t，J ＝6.0 Hz，H-8，8′），1.96（4H，m，H-9，9′），1.68（4H，m，H-10，10′），1.21（6H，t，J ＝6.0 Hz，H-11，11′）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：134.4（C-1，2），130.9（C-3，8），133.0（C-4，5），170.4（C-7，7′），67.6（C-8，8′），32.8（C-9，9′），21.3（C-10，10′），15.8（C-11，11′）。以上數據與文獻［7］ 基本一致，故鑒定為鄰苯二甲酸二異丁酯。

化 合 物 3： 白 色 粉 末。 ESI-MS m／z： 282［M］＋。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：5.37（2H，m，H-9，10），2.37（2H，t，J ＝7.5 Hz，H-2），2.07（4H，m，H-8，11），1.65（2H，m，H-9，10），1.33～1.27（20H，m，H-4-7，12-17），0.91（3H，m，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：180.1（C-1），34.8（C-2），25.2（C-3），30.3-29.9（C-4-7），28.0（C-8，11），130.5（C-9），130.8（C-10），29.8 ～29.4（C-12-15），32.7（C-16），23.2（C-17），14.8（C-18）。以上數據與文獻［8］ 基本一致，故鑒定為油酸。

化 合 物4： 白 色 固 體。1H-NMR （600 MHz，CDCl3）δ：7.93（2H，d，J ＝2.2 Hz，H-2，6），6.91（2H，d，J ＝2.0 Hz，H-3，5），2.58（3H，s，4-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：197.3（1-CHO），130.3（C-1），131.0（C-2，6），115.3（C-3，5），160.3（C-4），26.3（4-CH3）。以上數據與文獻［9］ 基本一致，故鑒定為對甲基苯甲醛。

化合物5：白色晶體（甲醇）。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：0.63（3H，s，H-18），0.82（3H，s，H-27），0.83（3H，s，H-26），0.85（3H，s，H-29），0.91（3H，s，H-21），1.02（3H，s，H-19），3.53（1H，m，H-3），5.36（1H，brs，H-6）；13CNMR（150 MHz，CDCl3）δ：37.3（C-1），31.7（C-2），71.8（C-3），42.3（C-4），140.8（C-5），121.7（C-6），31.9（C-7），31.9（C-8），50.2（C-9），36.5（C-10），21.1（C-11），39.8（C-12），42.4（C-13），56.8（C-14），24.3（C-15），29.8（C-16），56.1（C-17），11.9（C-18），19.1（C-19），19.8（C-20），18.8（C-21），36.0（C-22），26.2（C-23），45.9（C-24），29.5（C-25），19.3（C-26），19.8（C-27），23.1（C-28），12.0（C-29）。以上數據和文獻［10］ 基本一致，故鑒定為β-谷甾醇。

化合物6：淡黃色油狀液。ESI-MS m／z：280［M］＋。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：5.34（4H，m，H-9，10，12，13），2.80（2H，m，H-11），2.33（2H，t，J ＝7.6 Hz，H-2），2.05（4H，m，H-8，14），1.63（2H，m，H-3），1.25 ～1.31（14H，m，H-4-7，H-13-16），0.97（3H，t，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：179.9（C-1），34.1（C-2），24.7（C-3），29.0 ～29.7（C-4-7），27.2（C-8），130.0（C-9），128.1（C-10），27.5（C-11），130.2（C-12），128.1（C-13），27.2（C-14），29.8（C-15），32.0（C-16），22.7（C-17），14.1（C-18）。以上數據與文獻 ［11］ 基本一致，故鑒定為亞油酸。

化合物7： 白色固體。 ESI-MS m／z：121.06［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δ：7.02（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-7，8），6.69（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-6，9）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：130.94（C-1），156.70（C-5），116.08（C-6，9），130.85（C-7，8）。以上數據與與文獻［12］ 基本一致，故鑒定為2-oxabicyclo ［3，2，2］ nona-5，7，8-triene。

化合物8：淡黃色油狀物。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.04（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-2，6），6.78（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-3，5），2.84（2H，t，J ＝7.1 Hz，H-7），4.24（2H，t，J ＝7.1 Hz，H-8），2.03（3H，s，H-9）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3） δ：129.3（C-1），130.0（C-2，C-6），115.4（C-3，C-5），154.7（C-4），34.1（C-7），65.6（C-8），21.1（C-9），172.1（C-10）。以上數據與文獻［9］ 基本一致，故鑒定為2-（4-羥基苯基） 乙酸乙酯。

化合物9：黃色無定型粉末。1H-NMR（acetoned6，600 MHz）δ：7.28（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-6），6.71（1H，d，J ＝2.5 Hz，H-5′），6.61（1H，d，J ＝2.5 Hz，H-3′），6.37（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-4），2.77（3H，s）；13C-NMR（acetone-d6，150 MHz）δ：140.3（C-1），166.7（C-3），102.19（C-4），166.80（C-5），166.81（C-7），154.92（C-2′），160.08（C-4′）。以上數據與文獻［13］ 基本一致，故鑒定為alternariol。

化合物10：淺紫色非晶粉末。 ESI-MS m／z：272［M］＋。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：11.79（1H，s，2-OH），10.79（1H，s，10-OH），7.18（1H，brs，H-5），6.71（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-11），6.63（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-9），3.90（3H，s，H-4OCH3），2.72 （1H，s，8-CH3）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6） δ：99.3（C-1），164.6（C-2），98.4（C-3），166.2（C-4），101.6（C-5），137.9（C-6），117.1（C-7），138.6（C-8），103.1（C-9），152.1（C-10），108.6 （C-11）， 158.1 （C-12），164.1（C-13）。以上數據與文獻［14］ 基本一致，故鑒定為alternariol-4-methyl ether。

4 討論

內生菌在植物中廣泛分布，生物多樣性豐富，參與植物生長過程中的重要環節［15］，并且參與植物次生代謝成分的轉合，是天然產物的重要來源，其中大部分為新型生物活性物質，具有廣闊的應用前景［16］。近年研究發現，內生菌除產生抗癌物質外，還可產生具有其他藥用價值的活性物質，如抗生素、植物生長激素等［17］。現已有學者在藥用植物內生菌中成功提取分離得到生物堿類、芳香族、萜類及揮發油類、黃酮類及其苷類、酚類和內酯類［18-19］。本研究從新疆阿魏內生真菌Alternaria sp.TA26-16 中分離得到10 個化合物，所有化合物均為首次分離得到，以期為今后藥用植物內生真菌的研究提供實驗基礎和科學依據。