中華蜜蜂保種（資源）分子生物學評價方法

陳道印 蘇曉玲 趙東緒 華啟云

（金華市農(nóng)業(yè)科學研究院）

1 蜜蜂保種重要性

蜜蜂對于自然界以及人類社會來說，是一種具有巨大價值的社會性昆蟲。蜜蜂是自然界重要的授粉昆蟲，具有巨大的生態(tài)價值，在世界上已知的16萬種蟲媒植物中，蜂媒植物占85%[1]。對于人類社會來說，蜜蜂授粉已經(jīng)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮出顯著的社會效益和經(jīng)濟價值，聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）的調(diào)查結(jié)果表明，蜜蜂對世界各個地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)都有顯著的促進作用[2]。而蜜蜂生產(chǎn)的蜂蜜、蜂花粉等蜂產(chǎn)品，除了能夠提高人民的生活質(zhì)量外，還能為蜂農(nóng)帶來可觀的經(jīng)濟效益。

目前世界上人類飼養(yǎng)最多并且分布最廣的是東方蜜蜂（Apis cerana）和西方蜜蜂（Apis mellifera），它們是蜜蜂屬中的兩個不同的蜂種，在人為干預以及自然選擇的作用下又形成了許多不同的種質(zhì)資源。但目前在世界范圍內(nèi)，某一些品種因其優(yōu)良的經(jīng)濟性狀被盲目地引種，造成原有地方品種種群數(shù)量大大減少，這嚴重威脅了蜜蜂整體的種質(zhì)資源狀況。

分布于我國境內(nèi)的中華蜜蜂（Apis cerana cerana）是適應(yīng)于我國獨特森林生態(tài)系統(tǒng)的本土蜂種[3]。中華蜜蜂在長期的自然選擇過程中形成了具有極強適應(yīng)性的形態(tài)特征與生物學特性，在西方蜜蜂引入之前我國中華蜜蜂基本保留著多個地方品種[4]。從1896年起，具有優(yōu)良經(jīng)濟性狀的西方蜜蜂陸續(xù)被引入我國[5]，與中華蜜蜂發(fā)生了種間競爭并占據(jù)了種間競爭的優(yōu)勢，也帶來了許多東方蜜蜂不曾有過的病害。同時由于西方蜜蜂具有更加優(yōu)異的生產(chǎn)性狀，蜂農(nóng)更加喜愛飼養(yǎng)西方蜜蜂，人為進行飼養(yǎng)蜂種的更替，加劇了中華蜜蜂地方品種的丟失。近幾十年來我國本土中華蜜蜂分布范圍循序縮小，數(shù)量急劇下降，而西方蜜蜂以及其他授粉昆蟲對我國森林生態(tài)系統(tǒng)的彌補作用有限[6]，因此保護中華蜜蜂的種質(zhì)資源是當前必不可少的工作。近年來，隨著中蜂的勞動強度小、投入成本低、經(jīng)濟效益高等優(yōu)勢逐漸體現(xiàn)，部分地區(qū)出現(xiàn)了中蜂養(yǎng)殖熱情高漲的情況，一些地區(qū)的中蜂數(shù)量有所恢復。

中華蜜蜂的相關(guān)種質(zhì)資源鑒定工作也已經(jīng)開展。經(jīng)過學者們的一系列形態(tài)調(diào)查研究，初步劃分出以下9個中華蜜蜂的類型：長白山中蜂、阿壩中蜂、海南中蜂、西藏中蜂、北方中蜂、華南中蜂、華中中蜂、滇南中蜂、云貴高原中蜂。其中長白山中蜂以及阿壩中蜂由于其明顯的形態(tài)特征以及對當?shù)丨h(huán)境的適應(yīng)性，引起了政府部門的關(guān)注，先后建立長白山中蜂資源保護區(qū)以及阿壩州中蜂資源保護區(qū)。其他品種如西藏中蜂、海南中蜂等雖也具有明顯的形態(tài)以及生物學特征，但并未引起足夠的關(guān)注，受到環(huán)境變化、病害以及引種等影響，蜂群數(shù)量持續(xù)下降，亟需得到保護。廣泛分布于中國大陸的華南中蜂、華中中蜂、北方中蜂等，由于人為開墾農(nóng)田以及病害的影響，分布區(qū)域一度收縮并且呈現(xiàn)碎片化趨勢，但近年來部分地區(qū)的中蜂種群數(shù)量有所提升。作為適應(yīng)我國森林生態(tài)系統(tǒng)的本土蜂種，中華蜜蜂的現(xiàn)狀必須引起人們足夠的重視，保護我國現(xiàn)有的中蜂種質(zhì)資源。

2 蜜蜂種質(zhì)資源評價方法

中華蜜蜂種質(zhì)資源是畜禽資源的重要組成部分，也是我國生物多樣性的重要組成部分。種質(zhì)資源的管理主要包括種質(zhì)資源評價、品種保存和開發(fā)利用，而針對種質(zhì)資源的評價是資源管理最基本的環(huán)節(jié)[7]。

目前，對蜜蜂種質(zhì)資源的評價主要是通過遺傳標記從形態(tài)學特征以及生物學特性進行。近年來隨著分子生物學的發(fā)展，利用分子手段對蜜蜂種質(zhì)資源進行評價的工作也逐漸開展。

2.1 分子遺傳標記評價方法

分子遺傳標記技術(shù)由于可以直接反映生物個體或種群間的特征，已得到了廣泛應(yīng)用，是一種有效的遺傳標記。分子標記是可檢測并且穩(wěn)定遺傳的生物大分子，可直接反映基因水平上的遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性等差異。至今，微衛(wèi)星DNA標記和線粒體DNA片段標記，是蜜蜂種質(zhì)資源評價與鑒定中應(yīng)用最廣泛的分子遺傳標記，單核苷酸多態(tài)性SNP標記作為第三代分子標記將會發(fā)揮越來越大的作用。

2.1.1 微衛(wèi)星DNA

微衛(wèi)星標記（Microsatellite），又稱為簡單重復序列（SSR）或短串聯(lián)重復序列（STRs），通常由2～6個核苷酸重復構(gòu)成，均勻分布在真核生物基因組中。這種簡單重復序列在寄居蟹的基因組中第一次發(fā)現(xiàn)[8]，隨后在其他動物、酵母的基因組中都有發(fā)現(xiàn)，并且在研究人類基因組的微衛(wèi)星序列時，得到了微衛(wèi)星（microsatellite）的名字[9]。

2003年，西方研究者從西方蜜蜂的全基因組片段構(gòu)建文庫和細菌人工染色體克隆文庫中一共開發(fā)了552個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點，而其中有58%的位點可以在東方蜜蜂中成功擴增并具有多態(tài)性[10]。2008年，利用西方蜜蜂全基因組開發(fā)出了共2008個微衛(wèi)星位點[11]。而東方蜜蜂微衛(wèi)星標記開發(fā)相對西方蜜蜂較晚，2009年日本學者成功地在東方蜜蜂中開發(fā)出12個具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星位點[12]。除此之外，東方蜜蜂使用的微衛(wèi)星標記，多是基于西方蜜蜂已有的位點篩選出在東方蜜蜂中具有多態(tài)性的標記[13]。在蜜蜂領(lǐng)域內(nèi)，微衛(wèi)星被用于遺傳多樣性以及蜜蜂品種鑒定的研究[14]。

2.1.2 線粒體DNA標記

線粒體DNA是唯一的處于細胞核外的遺傳信息載體，其遺傳特性主要體現(xiàn)在：母性遺傳、多態(tài)、同一個體內(nèi)線粒體序列一致。線粒體具有高度多態(tài)、母系遺傳、較少重組以及高拷備數(shù)等特點，是研究中一種常見的分子標記[15,16]。在蜜蜂的研究領(lǐng)域中，一個蜂群通常有且僅有一只蜂王負責產(chǎn)卵，整個蜂群的線粒體結(jié)構(gòu)一致，因此在實際實驗過程中一只工蜂的線粒體就足以代表整個蜂群的特征。基于線粒體DNA標記的特點以及蜂群母系社會的特性，線粒體常被用于研究蜜蜂的分化鑒定等領(lǐng)域[17,18]。

隨著分子檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，分子實驗的成本大大降低，對線粒體序列片段進行直接測序以獲得豐富的遺傳信息變得可行，因此線粒體部分片段測序成為種質(zhì)資源多樣性檢測所使用的主要技術(shù)之一。在蜜蜂領(lǐng)域的研究中，tRNAleu～COII的非編碼區(qū)為主要檢測的線粒體片段，在近緣種西方蜜蜂的研究中起到了很好的種質(zhì)資源評價作用[17,19]。在東方蜜蜂的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，雖然該非編碼片段的變異程度相比西方蜜蜂有所減少，但仍然具有豐富的多態(tài)性[20]，依然適用于蜜蜂種質(zhì)資源多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)的評價。此外，COI、COII、16s RNA、Cytb等線粒體DNA片段也被應(yīng)用于東方蜜蜂的種質(zhì)資源評價中。

2.1.3 單核苷酸多態(tài)性SNP標記

單核苷酸多態(tài)性簡稱SNP標記，是指基因組上某個特定位置上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等變化，且該等位基因在種群中的比例不低于1%[21]。SNP標記具有數(shù)量多、分布廣和遺傳穩(wěn)定等特點，廣泛分布于基因組的編碼序列或非編碼區(qū)中。其中位于編碼區(qū)內(nèi)部的SNP位點（cSNP）較少，但對于研究生物的表型性狀等具有非常重要的意義，可以作為鑒定不同種質(zhì)資源的重要標記[22]。第三代高通量測序技術(shù)的推廣也為SNP的研究提供了便利。研究表明西方蜜蜂存在約830萬個SNP位點，其中分布于非洲的A支系擁有最高的基因突變頻率，存在約650萬個SNP位點，位于歐洲大陸的C支系僅有約220萬個SNP位點，不同支系的西方蜜蜂支間約有43%的SNP位于蛋白編碼區(qū)中[23]。在篩選西方蜜蜂抗白堊相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)SNP C2587245T位點與西方蜜蜂抗白堊病性狀高度相關(guān)[24]。隨著測序成本的逐漸降低，SNP標記將會在蜜蜂領(lǐng)域發(fā)揮越來越大的作用。

2.2 分子水平種質(zhì)資源評價相關(guān)指標

對種質(zhì)資源的評價，常用的指標有核苷酸多樣度、平均核苷酸差異數(shù)、單倍型多樣度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量、觀察雜合度、期望雜合度、香農(nóng)指數(shù)、基因豐富度等。

2.2.1 核苷酸多樣度（Pi）

核苷酸多樣度是指在一份樣本中，隨機挑選兩個序列比對，每一個位置可能出現(xiàn)不同的核苷酸頻率，或是指不同的核苷酸位點在總位點中所占的比率[25]。

2.2.2 平均核苷酸差異數(shù)（K）

平均核苷酸差異數(shù)是將全部個體核苷酸變異數(shù)的總和除以個體總數(shù)[25]。

2.2.3 單倍型多樣度（Hd）

單倍型多樣度是指在一份樣本中隨機抽到兩個不同單倍型的頻率，越高的單倍型多樣度意味著種質(zhì)資源的多樣性越豐富[25]。

2.2.4 雜合度

雜合度主要包括觀察雜合度和期望雜合度兩個指標，雜合度的高低與種群的適合度相關(guān)，若雜合度指標下降，意味著該種群滅絕的可能性增加[26]。

觀察雜合度（Ho），是指每個位點實際觀察到的雜合子的比例。期望雜合度（He），是指在Hardy-Weinberg平衡條件下，理論上雜合子所占的比例[27]。

2.2.5 多態(tài)信息含量（PIC）

多態(tài)信息含量，簡稱PIC值，指用作連鎖分析的父本與母本的配對而產(chǎn)生的子代中遺傳標記多態(tài)性的信息量。目前僅在關(guān)于人類的研究中認定PIC值≥0.6為具有豐富的多態(tài)信息含量[28]，對于其他物種的判斷尚未有明確的標準。在蜜蜂種質(zhì)資源的評價鑒定中，如何判斷PIC值的水平需要進一步研究。

2.2.6 香農(nóng)指數(shù)（I）

香農(nóng)指數(shù)多應(yīng)用于物種或種下的多樣性評價。在研究種質(zhì)資源多樣性時，香農(nóng)指數(shù)不僅可以體現(xiàn)等位基因數(shù)量的多少，還體現(xiàn)了不同等位基因所占的比例[29]。

2.2.7 基因豐富度（Rs）

基因豐富度也叫平均等位基因數(shù)（Na），表示每個位點上所有的等位基因的數(shù)量。由于受到有效種群大小的影響，該指標能夠反映種群數(shù)量在歷史上的波動。

2.2.8 有效等位基因數(shù)（Ne）

有效等位基因數(shù)是指在理想狀態(tài)下，形成與實際種群中相同的純合度（或雜合度）所需要的等位基因數(shù)。研究中常用平均有效等位基因數(shù)來評價種群遺傳多樣性水平。

2.2.9 Hardy-Weinberg平衡檢測

Hardy-Weinberg平衡認為在理想種群中，各等位基因的基因頻率和基因型頻率將保持在一個穩(wěn)定不變的水平。Hardy-Weinberg平衡受自然選擇、人工選擇、近交等諸多因素的影響，檢驗種群是否符合Hardy-Weinberg平衡，是評價種質(zhì)資源的基礎(chǔ)[30]。

2.2.10 F統(tǒng)計量

F統(tǒng)計量包括3個參數(shù)，分別為種群間近交系數(shù)Fit、種群內(nèi)近交系數(shù)Fis、種群間的分化程度Fst[31]。Fis、Fit分別相當于地方種群和所有種群中任何個體攜帶的一對等位基因是同源的概率；Fst是指任意兩個種群間的變異占所有變異的比例，是衡量兩個種群分化的一個參數(shù)。

3 結(jié)語

蜜蜂種質(zhì)資源保護是一項長期的任務(wù)，除了需要人類在保護自然環(huán)境方面做出更多努力外，相關(guān)領(lǐng)域的研究人員更需要先對現(xiàn)有的蜜蜂種質(zhì)資源進行評價，運用現(xiàn)有技術(shù)對中蜂進行品種鑒定，并建立起中蜂保種場。針對已有的保種場也要積極進行保種效果評估，為接下來的中蜂資源保護工作提供理論與實踐上的指導。