DNA條形碼技術(shù)及其在海洋貝類分類中研究進展

劉溪寧，陳睿，孫雙祥，張志祥

(寧波市惠貞書院，浙江 寧波 315000)

貝類屬于軟體動物門，在世界上的分布十分廣泛，貝類的種類豐富，目前已知有1.1萬余種。物種的分類與鑒定對生物學(xué)研究起基礎(chǔ)性作用，傳統(tǒng)的物種鑒定通過對生物外形特征的比較來鑒定物種。然而，許多貝類生物外形差異并不顯著，有些特征可能相重合，甚至會因為環(huán)境的誘導(dǎo)而出現(xiàn)趨同進化的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致隱種的普遍存在[1]。因此，利用傳統(tǒng)鑒定法不僅需要生物學(xué)家極高的專業(yè)知識素養(yǎng)，而且耗時較長，無法精準地對物種進行分類。隨著人們對食品安全的日益重視，以及對維持海洋生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的迫切需要，分類學(xué)急需完成較大的突破。

聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)的出現(xiàn)極大地推動了物種鑒定技術(shù)的發(fā)展，2003年加拿大生物學(xué)家Hebert教授首次提出DNA條形碼(DNA barcode)技術(shù)[2]。該技術(shù)利用特定的短DNA序列將物種進行比對，是效率較高且準確的物種鑒定方法。目前該技術(shù)已被運用于魚類、昆蟲類等物種的分類，得到了日益廣泛的關(guān)注[3]。本文主要對DNA條形碼技術(shù)在海洋貝類分類中的運用進行綜述,探討利用DNA條形碼技術(shù)進行海洋貝類分類的可行性與優(yōu)勢，為保護海洋貝類物種多樣性提供更加詳細的資料。

1 DNA條形碼技術(shù)的起源、發(fā)展與原理

1.1 DNA條形碼技術(shù)的起源與發(fā)展

DNA條形碼是使用標準化的DNA標記進行物種準確鑒定的技術(shù)，是運用變異較多的和已擴增成功的較短標準DNA條形碼片段，在生物種內(nèi)特異性與種間多樣性之間創(chuàng)建的身份鑒定系統(tǒng)，從而實現(xiàn)對物種的快速、高效識別。Arnot等最早提出DNA條形碼的概念，但一直到2003年Hebert提出建立一個基于DNA條形碼的數(shù)據(jù)庫以實現(xiàn)物種的快速鑒定后，DNA條形碼技術(shù)才得到了生物學(xué)界的普遍認可并得以快速發(fā)展[4]。2004年，美國建立了生物信息中心(NCBI)和生命條形碼聯(lián)盟(CBOL)，將物種條形碼標準DNA存入了GenBank中，在2009年國際生命條碼實施之后，一個基于所有真核生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫自動鑒定系統(tǒng)逐步建立。另外，信息技術(shù)的發(fā)展為海量數(shù)據(jù)處理提供了工具，推動了DNA條形碼技術(shù)的標準化使用，生命條形碼協(xié)會和國際生命條形碼計劃還創(chuàng)建了大量針對各類群DNA條形碼的數(shù)據(jù)庫，如ABBI、All-Lepsh和WoRMS等[5]。

1.2 DNA條形碼標記技術(shù)的原理與所選材料

DNA是由4種堿基(A、T、G、C)按照一定的順序構(gòu)成的基因序列，每個位點均有4種可能選擇，生物特有DNA條形碼標簽，僅僅15個位點就可產(chǎn)生415種選擇[1]。由于有的位點堿基受選擇壓力不隨環(huán)境的變化而改變，所以可以僅考慮蛋白質(zhì)編碼基因，根據(jù)密碼子通用的性質(zhì)，45個位點便可以形成10億種不同序列。如今的DNA測序技術(shù)能夠精準的檢測一段幾百bp長度的DNA序列，理論上，一段648 bp的DNA條形碼足以鑒定所有物種。DNA條形碼的原理是選擇高度保守且在物種進化水平變異細微的DNA編碼區(qū)或非編碼區(qū)片段用以鑒定物種，但是找到這種通用標準序列片段比較困難[6]。目前COⅠ、16S rRNA、18S rDNA、Cytb、ITS、rbcSp為常用的幾種通用片段[7-8]。

1.3 DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀

1.3.1COⅠ作為動物分類首選序列的優(yōu)勢

運用DNA條形碼技術(shù)鑒定物種，首先需要一個標準序列用以和樣本的序列進行比對。理想的DNA條形碼序列需符合以下標準。1)序列的兩端保守，能夠設(shè)計用于擴增的通用引物。2)序列的變異速率適宜，既能夠區(qū)別不同物種的生物，種內(nèi)遺傳變異又較小。線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ基因目前被普遍認同為標準的動物DNA條形碼序列[9-10]，因其具有以下優(yōu)勢。1)mtCOⅠ基因5’末端約648 bp的序列保守，具引物擴增通用性[4]。2)該基因無內(nèi)含子且嚴格遵循母系遺傳，重組率低，擁有較高的拷貝數(shù)，從而將PCR擴增過程簡單化[3]。3)mtCOⅠ序列具有較高的突變率，其堿基可能組合數(shù)遠大于物種數(shù)。4)mtCOⅠ密碼子第3位堿基的置換頻率高，使其進化速率約是12 s DNA和16S DNA的3倍，具更多系統(tǒng)發(fā)育信息[6]。5)mtCOⅠ基因種間遺傳距離基本小于1%，遠小于種間遺傳距離。Hebert在提出DNA條形碼概念時，便運用COⅠ序列分析了動物界11門13 320個物種，其中可被明確鑒定的物種數(shù)占比高達98%[9]，可見使用mtCOⅠ基因作為標準序列的可行性。而目前COⅠ序列更是被廣泛應(yīng)用于魚類、貝類、昆蟲類等物種的鑒定[11-15]，發(fā)揮了極大的作用。

1.3.2 其他DNA條形碼序列

高等植物的線粒體基因的進化速率十分緩慢，因此COⅠ序列并不能夠作為植物的通用DNA條形碼，通常使用cpDNA序列鑒定植物物種[8]。然而，研究結(jié)果顯示，目前全世界高等植物約有30萬種，且多倍體植物常見，又具有高種間雜交率，導(dǎo)致單基因組標記往往無法準確鑒別不同種植物。因此，第三屆國際DNA條形碼學(xué)術(shù)大會確定了將葉綠體rbcL與matK的基因組合作為植物DNA標準條形碼，其對植物的鑒定率達到了72%[6]；同時將葉綠體trnH-psbA和ITS作為補充條形碼[16]。但植物標準DNA條形碼至今沒有確定。菌類由于結(jié)構(gòu)十分簡單，僅形態(tài)鑒定幾乎無法將其區(qū)分，其條形碼研究主要運用rDNA或某些功能蛋白基因，如16S rDNA、ITS、微管蛋白基因等[5]。

1.3.3 DNA條形碼技術(shù)的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)

對物種的準確鑒定是描述生物多樣性的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)物種鑒定基于對物種的形態(tài)觀察與解剖，受物種生長發(fā)育的階段與環(huán)境，以及鑒定者個人素質(zhì)的影響。DNA條形碼技術(shù)則可以彌補傳統(tǒng)鑒定法的不足。相對于傳統(tǒng)法來說，利用DNA條形碼技術(shù)進行物種鑒定具有以下優(yōu)勢：1)由于物種生長時DNA序列并未發(fā)生變化，因此DNA條形碼技術(shù)不受個體發(fā)育階段和生長環(huán)境的影響，準確性較高；2)操作技術(shù)簡單，通用性高，可實現(xiàn)一次性對大量樣本的鑒定，對鑒定人員個人素質(zhì)的要求不高；3)對樣本要求低，DNA樣本僅0.1 g便足以進行鑒定，且不需樣本的高完整性，即使樣本被降解也可用于鑒定，避免了鑒定人員的主觀誤差[17-19]；4)可將數(shù)據(jù)發(fā)送至BOLD數(shù)據(jù)庫，從而實現(xiàn)資源的全球性共享。然而由于部分物種可能存在種內(nèi)分化過高、種間分化不足的現(xiàn)象，種內(nèi)與種間遺傳距離可能重合，導(dǎo)致鑒定的不準確；同時，葉綠體與線粒體遵循單親遺傳，不利于鑒定雜交物種[20]；并且，一些新形成的物種差異可能非常小，能否運用DNA條形碼技術(shù)鑒定這些物種仍存在爭議。遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫的完備程度決定了DNA條形碼技術(shù)鑒定物種的準確性[21]，然而，相對于龐大的生物物種數(shù)量來說，目前BOLD等數(shù)據(jù)庫收錄的DNA序列數(shù)目實在過于渺小，積極開發(fā)DNA序列是科研工作者們的必經(jīng)之路。

2 DNA條形碼技術(shù)在貝類分類中的應(yīng)用

2.1 簾蛤目

簾蛤目屬軟體動物門、雙殼綱。在我國，簾蛤目動物分布十分廣泛且數(shù)目繁多，外形相似，依靠形態(tài)學(xué)方法將其分類的難度非常大。使用DNA條形碼技術(shù)分類則使分類難度大大降低。王琳楠等[22]選取了簾蛤目16個物種110個個體進行研究，測得其COⅠ基因序列的種內(nèi)平均遺傳距離為0.010 6，雖然裂紋哥特蛤的遺傳距離達到了0.018 2，但仍然在DNA條形碼COⅠ基因種內(nèi)遺傳距離2%的界限內(nèi)；種間平均遺傳距離高達0.388 4，遠大于種內(nèi)遺傳距離，完全符合作為DNA條形碼基因序列所需滿足的要求。將這些DNA條形碼序列與BOLD中的已知序列對比，匹配率達100%。該研究的分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相同，驗證了形態(tài)學(xué)鑒定的準確性。孟學(xué)平等[23]通過計算發(fā)現(xiàn)，長樂、漳州地區(qū)西施舌類群與其他地區(qū)的COⅠ基因種內(nèi)遺傳距離過大，從而證明了福建西施舌是西施舌的一個亞種。

2.2 珍珠貝亞目

珍珠貝亞目在雙殼類軟體動物中最具經(jīng)濟價值。馮艷微[24]對扇貝科的8個種63個個體的mtCOⅠ和16S rRNA的部分基因序列進行測序，結(jié)果表明mtCOⅠ種內(nèi)遺傳距離平均0.004 8，種間遺傳距離平均0.284；16S RNA種內(nèi)遺傳距離平均0.001，種間遺傳距離平均0.231；兩者的種間遺傳距離都遠大于種內(nèi)，存在明顯的條形碼間隙，能夠有效鑒定扇貝科物種，但比較而言，COⅠ基因更適合作為珍珠貝亞目DNA條形碼的標準基因。

2.3 貽貝目

貽貝目分布廣泛，具有較高的食用價值。以往的形態(tài)學(xué)鑒定法往往根據(jù)其殼形、刻紋、閉殼肌痕等特征進行分類，難度較大。劉君采集了貽貝科3亞科、8屬、11種共52個樣品并擴增其COⅠ基因[25-26]，使用COⅠ的通用引物能夠成功擴增10個種的基因，可見COⅠ引物有較高適用性；結(jié)果顯示，除凸殼肌蛤外，COⅠ基因的種內(nèi)遺傳距離平均小于2%，種間遺傳距離均在20%以上，最大可達60%左右，完全符合Hebert提出的10x規(guī)則[19]。且貽貝科COⅠ基因的種間遺傳距離明顯大于其他生物類群，可見COⅠ基因序列十分適合作為貽貝科的DNA條形碼標準序列。研究同時表明，凸殼肌蛤之所以種內(nèi)遺傳距離過大，是因為存在線粒體雙單親遺傳模式，父本線粒體的M和F類型都可能遺傳給子代。因此試驗時應(yīng)盡量避免這種模式的干擾，首選提取貝類的閉殼肌組織。

2.4 其他貝類

除上述貝類之外，DNA條形碼技術(shù)在鑒別其他貝類時同樣被廣泛地運用。劉君等[25]將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于牡蠣科(Ostreidae)的48個樣品，得到30條COⅠ序列和47條16S rDNA序列。經(jīng)過研究表明COⅠ基因能較好分辨各個種，16S rDNA能較好的區(qū)分近緣種之外的大部分種類。經(jīng)過遺傳距離法分析證實，在牡蠣科中的巨牡蠣屬(Crassostrea)為代表的一些種類，16S rDNA序列的遺傳變異小于COⅠ序列。由此證明，COⅠ基因的使用效率大于16S rDNA。在對釘螺屬(Oncomelania)的研究中， 徐玉梅等[27]選取安徽分別代表長江上、中、下游的3個地區(qū)水域所采集的釘螺，進行COⅠ基因分析，結(jié)果顯示，3種不同水域釘螺種類的一致性達到98%及以上，表明基于COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)在釘螺科應(yīng)用的有效性[16]。

3 前景與展望

海洋貝類與人類息息相關(guān)，可供食用、藥用或作為餌料，并且醫(yī)學(xué)貝類種類繁多，是大量的對人體有害的吸蟲或線蟲的中間宿主。加快推動DNA條形碼技術(shù)在海洋貝類分類與鑒定中的應(yīng)用，合理正確地對海洋貝類進行分類，具有很大的醫(yī)學(xué)價值。隨著試驗的不斷深入，DNA條形碼的數(shù)據(jù)庫將逐漸被完善，檢索也將會變得更加便捷高效。雖然DNA條形碼的應(yīng)用前景良好，但它的發(fā)展是建立在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上的。因此，DNA條形碼技術(shù)并不可能取代傳統(tǒng)鑒定法而獨立存在。我們在積極研究DNA條形碼序列的同時，也應(yīng)時刻注意與形態(tài)學(xué)的結(jié)合，如此才能夠使DNA條形碼技術(shù)達到更高的水平。