淫羊藿苷對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞免疫功能的影響

劉君雯，劉天明，李敬雙，于鳳梅，段權(quán)倩，張 楊，吳 瓊，李 敏

（錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001）

淫羊藿，又稱(chēng)仙靈脾，為小檗科植物淫羊藿的全草，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、延緩衰老等作用。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，屬于黃酮類(lèi)化合物[1]，在藥典的記載中，淫羊藿苷不僅具有降血壓、補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)除濕等作用，而且對(duì)腰部和膝蓋無(wú)力以及中年健忘也有一定的治療作用。近年來(lái)，淫羊藿苷的免疫調(diào)節(jié)作用在人類(lèi)醫(yī)學(xué)上研究較多，其中調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用已成為研究熱點(diǎn)之一，在保健品領(lǐng)域也已經(jīng)有了很廣泛的應(yīng)用[2]。然而，淫羊藿苷在動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用卻很少，淫羊藿在我國(guó)分布廣泛，將淫羊藿苷做為飼料添加劑會(huì)有很好的應(yīng)用前景。本研究通過(guò)體外分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞，檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能和脾淋巴細(xì)胞增殖以及對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，探討淫羊藿苷對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的免疫功能的調(diào)節(jié)作用，為淫羊藿苷的開(kāi)發(fā)和利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物8周齡，體重為20±2 g，SPF級(jí)Balb/c小鼠，由錦州醫(yī)科大學(xué)提供。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌（菌種號(hào)：AB91093），購(gòu)自中國(guó)微生物研究院。

1.1.3 藥品和主要試劑 淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品成都曼思特生物科技有限公司產(chǎn)品，左旋咪唑廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，新生牛血清、臺(tái)盼藍(lán)、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、RPMI-1640培養(yǎng)基和二甲基亞砜（DMSO）Solarbio公司產(chǎn)品，IL-2、IL-4、IL-10和IL-12試劑盒博士德公司產(chǎn)品，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 淫羊藿苷試劑的制備 稱(chēng)取淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，溶于1.0 mL DMSO中，搖勻至全部溶解，加入10 mL RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢⑸鲜鲆后w吸取10 μL與10 mL RPMI-1640培養(yǎng)液混勻，按照此方法得到了淫羊藿苷藥液母液，其終濃度為1.0 μg/mL，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，4℃保存。試驗(yàn)時(shí)所需要的淫羊藿苷濃度用RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。

1.2.2 腹腔巨噬細(xì)胞懸液制備 小鼠頸椎脫臼法處死，浸泡于75%酒精消毒約3 min，用5 mL注射器抽取3 mL RPMI-1640培養(yǎng)基注入腹腔內(nèi)，輕揉拍打腹部3 min后，用注射器抽取腹腔內(nèi)培養(yǎng)基于離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)上述操作2次。吹勻后靜置5 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)1次。將細(xì)胞沉淀用RPMI-1640完全培養(yǎng)基懸起，臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)達(dá)到95%以上，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL[3-4]。

1.2.3 脾淋巴細(xì)胞懸液制備 小鼠頸椎脫臼法處死，浸泡于75%酒精消毒約3 min，在超凈臺(tái)內(nèi)剪開(kāi)小鼠腹壁，取出脾置于盛有磷酸鹽緩沖（PBS）的培養(yǎng)皿中，反復(fù)沖洗2次后置于RPMI-1640培養(yǎng)基中，用5 mL注射器抽取培養(yǎng)基吹打，重復(fù)上述操作直至脾被膜透明。將細(xì)胞懸液收集于離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入3 mL Tris-NH4Cl，吹勻，靜置5 min，離心，重復(fù)上述操作直至紅細(xì)胞全部裂解。細(xì)胞沉淀用RPMI-1640完全培養(yǎng)基懸起，臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)達(dá)到95%以上。調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL，制成脾淋巴細(xì)胞懸液[5-7]。

1.2.4 淫羊藿苷對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL巨噬細(xì)胞懸液，設(shè)空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及淫羊藿苷組，每組均設(shè)5復(fù)孔。空白對(duì)照組每孔加100 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組每孔加100 μL左旋咪唑溶液（終濃度為5 μg/mL），淫羊藿苷不同濃度組每孔分別加入100 μL含不同濃度的淫羊藿苷（使其終濃度分別為1.5、3、6和12 μmol/L）溶液。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入50 μL金黃色葡萄球菌懸液。繼續(xù)培養(yǎng)9 h，每孔加20 μL MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 800 r/min離心10 min，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min直至形成紫色溶液，酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值[8]。

1.2.5 淫羊藿苷對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響 按照上述方法制備淫羊藿苷誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35 h，每孔再加入50 μL金黃色葡萄球菌懸液。培養(yǎng)9 h，每孔再加入20 μL MTT，振蕩混勻。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 500 r/min 4℃離心10 min，棄上清。每孔分別加入150 μL DMSO液，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處OD值。結(jié)果應(yīng)用公式計(jì)算：刺激指數(shù)SI=藥物刺激孔OD值/空白對(duì)照孔OD值[9]。

1.2.6 淫羊藿苷對(duì)淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響 用24孔培養(yǎng)板制備淫羊藿苷誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 h后1 500 r/min離心5 min，收集上清于試管中。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定分泌液中IL-2、IL-4、IL-10和IL-12濃度[10-11]。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行一維方差分析，P＜0.05表示組間差異顯著，P＜0.01表示組間差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 淫羊藿苷對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 如表1所示，淫羊藿苷各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組巨噬細(xì)胞的OD值均極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），淫羊藿苷為3 μmol/L劑量組巨噬細(xì)胞的OD值與陽(yáng)性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05），表明淫羊藿苷能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。淫羊藿苷各劑量組之間進(jìn)行比較，3 μmol/L劑量組巨噬細(xì)胞的OD值顯著高于1.5 μmol/L劑量組（P＜0.05），極顯著高于6 μmol/L和12 μmol/L劑量組（P＜0.01），表明淫羊藿苷對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬功能呈雙重調(diào)節(jié)作用，3 μmol/L劑量組效果較佳。

Table 1Effect of icariin on macrophages phagocytic表1淫羊藿苷對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

2.2 淫羊藿苷對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響 如表2所示，淫羊藿苷各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)均極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），淫羊藿苷為1.5、3和6 μmol/L劑量組淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05），表明淫羊藿苷能夠刺激淋巴細(xì)胞的增殖。淫羊藿苷各劑量組之間進(jìn)行比較，3 μmol/L劑量組淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)與1.5 μmol/L和6 μmol/L劑量組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05），但顯著高于12 μmol/L劑量組（P＜0.05），表明淫羊藿苷對(duì)刺激淋巴細(xì)胞的增殖呈雙重調(diào)節(jié)作用，淫羊藿苷為3 μmol/L劑量組效果較佳。

表2 淫羊藿苷對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響Table 2Effect of icariin on lymphocyte proliferation

2.3 淫羊藿苷對(duì)淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響ELISA法測(cè)定淫羊藿苷對(duì)淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4、IL-10和IL-12的分泌的影響，結(jié)果如表3所示。淫羊藿苷各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組各細(xì)胞因子的分泌水平均極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），淫羊藿苷為3 μmol/L劑量組淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4和IL-12的分泌與陽(yáng)性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05），淫羊藿苷為1.5 μmol/L和3 μmol/L劑量組淋巴細(xì)胞IL-10的分泌與陽(yáng)性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05），表明淫羊藿苷能夠刺激淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4、IL-10和IL-12的分泌。淫羊藿苷各劑量組之間進(jìn)行比較，3 μmol/L劑量組IL-2分泌顯著高于1.5 μmol/L劑量組（P＜0.05），極顯著高于6 μmol/L和12 μmol/L劑量組（P＜0.01）；該組IL-4和IL-12的分泌水平也均極顯著高于其他劑量組（P＜0.01）；但I(xiàn)L-10的分泌水平雖稍高于其他劑量組，但無(wú)明顯差異（P＞0.05）。表明淫羊藿苷對(duì)刺激淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4、IL-10和IL-12的分泌呈雙重調(diào)節(jié)作用，淫羊藿苷為3 μmol/L劑量組效果較佳。

3 討論

淋巴細(xì)胞增殖、巨噬細(xì)胞的吞噬以及細(xì)胞因子的分泌是評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。李書(shū)桐等[12]研究了淫羊藿苷對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響，結(jié)果顯示淫羊藿苷能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的功能。對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的研究，多數(shù)都利用中性紅，本研究顯示淫羊藿苷能夠提高腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬金黃色葡萄球菌能力，表明淫羊藿苷增強(qiáng)了機(jī)體對(duì)于外來(lái)病原體的固有免疫反應(yīng)能力，此類(lèi)報(bào)導(dǎo)甚少。Zhao L M等[13]通過(guò)觀察淫羊藿苷對(duì)化療后小鼠免疫細(xì)胞的影響，結(jié)果淫羊藿苷能夠增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖能力、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。潘曉明[14]研究了淫羊藿苷對(duì)免疫細(xì)胞及免疫系統(tǒng)的影響，結(jié)果淫羊藿苷能夠促進(jìn)IL-12的產(chǎn)生。肖幸豐等[15]的研究表明淫羊藿苷能夠促進(jìn)Con A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖以及IL-2的生成。本研究結(jié)果顯示淫羊藿苷能夠提高腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，刺激淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4、IL-10和IL-12的分泌。與已報(bào)道的試驗(yàn)結(jié)果一致，提示淫羊藿苷可能通過(guò)激活靜止的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使其活化，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞分化增殖產(chǎn)生細(xì)胞因子，從而發(fā)揮免疫增強(qiáng)的作用。

Table 3 Effect of icariin on cytokines secreted by lymphocyte表3 淫羊藿苷對(duì)淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響