液體發酵高產靈芝多糖培養基的篩選與配方優化

馮東英 楊 寧 劉 爽 戴洪琨 賈傳福 杜新永

（聊城大學農學院，山東聊城252000）

靈芝（Ganoderma lucidum）屬擔子菌綱多孔菌目多孔菌科靈芝屬，是我國傳統的藥用真菌，具有較高的藥用價值和經濟價值。近年來文獻報道表明，靈芝多糖是靈芝中最重要的活性成分，具有免疫調節、抗腫瘤、抗病毒等[1-3]多種功效。而且，毒理學臨床實驗表明，靈芝多糖不會對人體健康造成負面影響[4]。

培養基對于靈芝菌絲生長、多糖產量有顯著的影響。靈芝液體深層發酵，一般選擇蛋白胨、酵母泥、麩皮、米糠[5-8]等作為培養基，也有采用中藥渣[9]，均取得了不錯的結果。試驗選擇了酵母泥、黃豆粉、玉米粉、麩皮以及中藥藥渣作為培養基主要成分，對靈芝液體發酵培養基進行優化，以期獲得最佳的靈芝多糖高產配方。

1 材料與方法

1.1 供試材料

靈芝菌種（泰山赤芝），由山東聊城冠縣靈芝栽培基地提供；蛋白胨為國藥集團產品，自購；中藥渣由青島潤達生物科技有限公司提供；酵母泥由杭州美亞生物科技有限公司提供。

1.2 供試培養基

靈芝基礎培養基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，去離子水1000 mL。

供試培養基（酵母泥、玉米粉、黃豆粉、麩皮、雜木屑、黃芪藥渣、甘草藥渣、金銀花藥渣）按干重20 g/L的量添加到基礎培養基中，為保證發酵效果，保留5 g/L的蛋白胨，其他成分比例不變。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同培養基液體發酵培養試驗

將試管菌種接種到基礎培養基（500 L錐形瓶，裝入液體培養基200 mL）中，25℃搖瓶培養3 d后，作為種子培養基，按5%接種量，分別接入試驗培養基中（500 L錐形瓶，裝液量200 mL），相同條件下培養3 d。

1.3.2 培養基正交優化試驗

根據1.3.1試驗結果，按照來源廣泛、物美價廉的原則，選擇黃豆粉、酵母泥、葡萄糖進行三因素、三水平的正交優化試驗。

1.4 測定方法

1.4.1 發酵液pH

pH檢測采用玻璃電極檢測。

1.4.2 菌絲球個數的統計

用剪掉尖頭的5 mL移液槍，吸取發酵完成（72 h）的靈芝發酵液10 mL，轉移到培養皿中計數。

1.4.3 菌絲體生物量

離心（3000×g，20 min）后，50℃烘干沉淀，減去對照值后計算。

1.4.4 靈芝多糖的提取與得率計算

靈芝多糖提取采用熱水浸提，噴霧干燥后測定得率。取干燥的靈芝菌絲體100 g，加1000 mL水，煮沸后維持1 h，離心（3000×g，20 min）去掉沉淀后，上清液噴霧干燥（進風口175℃、出風口80℃、處理速度240 mL/h）。

1.5 數據處理與分析

生長指標相關性分析、正交試驗設計、單因素顯著性分析等，均用SPSS完成。

2 結果與分析

2.1 供試培養基靈芝液體培養結果

從靈芝液體深層發酵的生產指數來看，發酵液pH的下降是靈芝菌絲開始迅速生長的重要指標之一，但是，pH的下降以及發酵結束的pH與靈芝多糖的得率之間的相關性不強。從表1中可以看出，pH下降速度最快的分別是麩皮、玉米粉，但是麩皮培養基的靈芝多糖得率低于基礎培養基（77%，按照基礎培養基為100%，下同），玉米粉培養基的靈芝多糖得率略高于基礎培養基（108%）。郭天龍采用米糠、麩皮作為主要原料液體培養靈芝，獲得10.37 g/L的菌絲體生物量，4.279 g/L、7.644 g/L的胞內和胞外靈芝多糖[5]。試驗多糖得率較低，可能與發酵液pH下降太快有關系。程秀芳等對六株來源于不同地區的靈芝菌株同條件液體發酵，確定了pH3.5～4.5，鏡檢菌絲出現少量自溶點時作為發酵終點，此時靈芝胞內多糖含量最高[10]。

試驗發酵結束后，不同培養基的最終pH在4.39～5.23，靈芝多糖得率較高的黃豆粉（145%）、酵母泥（123%）培養基的最終pH均在4.8左右。張曉云采用酵母浸粉為主要原料培養龍芝一號，獲得了6.28 g/L的菌絲體生物量和1.68 g/L的胞內靈芝多糖[7]。陳功明選擇了酵母粉作為主要培養基，培養赤芝，獲得了11.26 g/L的菌絲體生物量和1.63 g/L的胞內靈芝多糖[5]。從表1中可以看出，試驗采用酵母泥作為主要培養基成分時，獲得了9.04 g/L的菌絲體生物量，以及1.89 g/L的靈芝多糖，與上述文獻報道具有一定的吻合度，說明酵母泥是靈芝深層發酵的優選培養基之一。

從表1的數據可以看出，試驗最佳的培養基為黃豆粉，同樣培養條件下，獲得了13.09 g/L的菌絲體生物量和2.24 g/L靈芝多糖。

2.2 靈芝菌絲生長性狀與多糖得率相關性分析

結合表1的數據以及相關報道[8]，可以看出靈芝發酵過程中，菌絲球的個數與靈芝菌絲體生物量、靈芝多糖得率具有較好的相關性。喬雙逵等觀察分析了靈芝深層發酵時，菌絲球的大小及個數與菌絲體產量、靈芝多糖得率關系，結論是中小型菌球比例較高時有利于胞外多糖的合成，并且小型菌球比例大于大型菌球時，發酵液中多糖含量較高[12]。

由圖1、表2可見，菌絲球個數、菌絲體生物量、靈芝多糖得率三者之間均具有較好的正向相關性。以靈芝多糖得率為評價標準，則菌絲體生物量與靈芝多糖得率具有極顯著的相關性（0.829）、而菌絲球個數與靈芝多糖得率也具有顯著的相關性（0.789），皮爾森（Person）雙尾檢驗標準為（P＜0.01）。

圖1 靈芝菌絲生長性狀與多糖得率相關性分析散點圖

表1 供試培養基靈芝液體培養結果

表2 靈芝菌絲生長性狀與多糖得率相關性分析

2.3 正交法優化培養基配方

根據前期試驗結果，去掉培養基中的蛋白胨成分，選擇黃豆粉、酵母泥、葡萄糖作為靈芝深層發酵的主要培養基，同時參照1.3.1“基礎培養基”添加相應的無機鹽，利用SPSS進行培養基正交優化設計。因素水平見表3。

表3 正交試驗的因素水平

按照表4的正交方案進行試驗，記錄靈芝多糖的得率。極差分析方法結論是，靈芝發酵培養基中，對靈芝多糖產量的影響因素次序是黃豆粉＞葡萄糖＞酵母泥，最優培養基組合為A3B1C3，即：黃豆粉15 g/L，酵母泥5 g/L，葡萄糖20 g/L，添加 KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，初始pH為6.0左右。

表4 正交試驗結果

參照上述配方，按照1.3.1所述條件搖瓶培養靈芝，最終的靈芝多糖得率為4.99%，略低于表4中試驗4，可能跟試驗操作的誤差有關。

表5的統計分析結果與表4的極差分析結果基本相同，其中，黃豆粉用量的顯著性為0.007，符合P＜0.05的標準，即黃豆粉用量對靈芝多糖的產量具有顯著性影響；而葡萄糖、酵母泥用量的顯著性檢驗值均高于0.05，即這兩種培養基對于靈芝多糖的最終得率不具有顯著性影響。

表5 主旨間效果檢定（響應值：靈芝多糖得率/%）

綜上所述，結合經濟性的原則，在盡量減少培養基用量的情況下，獲得最大的產出，試驗最終確定的培養基配方為表4的第4個試驗設計，即黃豆粉10 g/L，酵母泥5 g/L，葡萄糖10 g/L，添加KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

依照上述配方，利用100 L發酵罐進行驗證試驗（26℃、發酵72 h），最終收獲靈芝多糖130 g，固體投料量為2650 g，折合靈芝多糖得率為4.9%。

3 小結

靈芝液體發酵過程中，發酵液pH的降低是靈芝菌絲開始迅速生長的標志，但是pH的變化與靈芝多糖的得率沒有相關性。靈芝菌絲球個數與菌絲體生物量與靈芝多糖的得率有著顯著的正相關性（0.789，0.829），說明提高靈芝液體發酵過程中菌絲球數量可以提高靈芝多糖的得率。

黃豆粉、酵母泥都是靈芝液體培養獲取多糖良好培養基；試驗中采用的中藥渣對于靈芝菌絲的生長均有一定的抑制效果，發酵效果不理想。

經過正交優化，得到的最優培養基配方為：黃豆粉 10 g/L，酵母泥 5 g/L，葡萄糖 10 g/L，添加KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。100 L發酵罐進行驗證試驗（26℃、發酵72 h），最終收獲靈芝多糖噴霧干燥粉130 g（得率4.9%）。