棉花細胞質雄性不育的研究與利用

王學德

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棉花細胞質雄性不育的研究與利用

王學德

（浙江大學農業與生物技術學院，杭州 310058）

棉花具有十分明顯的雜種優勢。雜交棉通常比常規棉增產15%左右，而且在纖維品質、抗病、抗蟲、抗逆境和光合效率等性狀上也有明顯改良。在棉花雜種優勢的利用中，最重要的環節之一是雜交種子的生產（制種）。目前，雜交棉制種常有四條途徑，人工去雄授粉法制種、化學殺雄法制種、利用核雄性不育的“兩系法”制種和利用細胞質雄性不育的“三系法”制種。生產實踐表明，利用棉花雄性不育既可簡化制種又可節省成本，特別是利用棉花細胞質雄性不育系、保持系和恢復系的“三系法”制種，可較有效克服其他制種方法的一些缺點，是最有效的途徑。為此，文章在闡述棉花雜種優勢利用途徑的基礎上，重點綜述棉花細胞質雄性不育的遺傳學、細胞學和生理生化的特點；深入闡述不育細胞質對雜種F1的正/負效應，并就如何培育強恢復系的問題，以培育轉的強恢復系為例，探討克服不育細胞質對雜種F1負效應的可能機制；根據棉花為常異花授粉作物和花器具有蟲媒花特征的特點，詳細介紹三系雜交棉制種的親本（不育系和恢復系）選配、地點選擇和環境優化等條件，以及如何綜合優化這些條件提高制種產量的關鍵技術。利用棉花細胞質雄性不育的“三系法”制種，與其他作物比較，在雜種優勢利用中具有4個突出的優點：（1）不育系為無花粉不育類型，育性不受氣候等環境的影響，可保證雜種的純度；（2）棉花開花期長達3個月，不存在制種時花期不遇的現象，制種產量有保證；（3）棉花生態適應性廣，育成的組合可在各地種植，種子產業化效益明顯；（4）可利用種間（海島棉與陸地棉間）雜種優勢。可以預言，基于細胞質雄性不育的三系雜交棉是大有前途的，將是棉花雜種優勢利用的主要途徑。最后，就本領域的發展趨勢，特別是在利用現代生物技術培育新的不育系和恢復系方面進行了初步探討。

棉花；細胞質雄性不育；雜種優勢

棉花具有十分明顯的雜種優勢，雜交棉通常比親本（純合品種，也稱常規棉）增產15%左右，同時也可綜合親本的優質和抗病蟲等性狀。隨著棉花精細播種、育苗移栽、地膜覆蓋和點播稀植等技術的推廣，以及制種技術的不斷改良，使棉花雜種優勢能夠在生產上大面積應用。近年來，中國雜交棉種植面積已達棉田總面積的15%—30%。

1 棉花雜種優勢的利用途徑

棉花雜種優勢的利用最重要的環節是雜交種子的生產，即人為控制棉花異交，使2個不同親本的性狀互補而產生具有雜種優勢種子的過程。為實現雜交，一般將一親本中的雄蕊去掉（或使它不能產生有活力的花粉粒），留下正常的雌蕊，即：人為地將其兩性花轉變為單性花。采用的方法常有3種：人工去雄法、化學殺雄法和雄性不育的利用。去雄后的花朵，只有授予花粉才能結種（雜交種子）。采用的授粉方式為人工授粉或自然昆蟲授粉，或2種授粉方式相結合。

棉花是常異花授粉作物，其花朵的結構具有蟲媒花的特征（花冠大而鮮艷，花器官中具有蜜腺，以及花粉粒表面具有棘突等等），在通常環境條件下，有3%—20%的異花授粉率。如果棉田有豐富的傳粉昆蟲（如養蜂），這種異花授粉率將會大幅度提高，為基于雄性不育的雜交種子生產提供了較高的天然異交率，從而省去授粉環節。但由于棉花是常異花授粉作物，不育系的繁殖和雜交種的制種均需要建立隔離區，以防止其他棉花品種的花粉傳入繁種田或制種田。隔離區距離要根據地形、蜜源植物及傳粉昆蟲的多少等因素來確定，一般距離0.5—1 km。隔離區內不種其他棉花。

1.1 人工去雄授粉法制種

棉花人工去雄授粉法制種，是指用人工除去母本花朵中的雄蕊，然后授以父本花粉，獲得雜交種子的過程。棉花花器較大，用人工去雄較容易。通常，將開花前一天的母本花蕾剝除雄蕊，次日上午取父本花粉授于已去雄的母本柱頭上，當棉花種子成熟時，按組合收獲其雜交種子，從而實現人工去雄授粉法制種的全過程。

在人工去雄授粉制種田里，母本與父本常按適當行比例間隔種植，如：母本每種4—6行，父本種1—2行，即4—6﹕1—2間隔種植。制種時，每天下午對母本行進行人工去雄，每天上午取旁邊的父本花粉給前一天去雄的母本授粉，操作方便。在棉花開花的整個時期（約70 d），需每天去雄和授粉，以產生足夠量的雜交種子。據估計，每人每天可生產0.5 kg雜交種子。在生產上，為節省雜交種子的用種量，常采用點播、營養缽育苗移栽和適當稀植等技術，0.5 kg的雜交種子常可供667 m2棉田的播種。

人工去雄授粉法制種，優點是雜交組合選配容易，育種周期短，應變能力強；缺點是費工和成本高，適用于勞動力價格較低的地區。

1.2 化學殺雄法制種

選用適當的化學藥劑，配成適當濃度的水溶液，在棉花開花初期，噴灑在棉花植株上，由于雄配子比雌配子對藥劑更敏感，雄配子被殺死造成雄性不育，而雌配子不受影響仍正常可育，這種致使雄性不育的化學藥劑稱為“化學殺雄劑”。經化學處理后的雄性不育棉花作母本，授以父本正常可育花粉，就可獲得雜交種子。用化學殺雄法制種，省去了人工去雄的環節，可大大降低制種成本。

在棉花上，曾使用過的化學殺雄劑主要有：二氯丙烯、二氯酸鈉（又稱茅草枯）、二氯異丁酸、二氯乙酸、順丁烯二酸、青鮮素（簡稱MH30）、二氯異丁酸鈉（又稱232或FW-450）等。這些化學藥劑均有不同程度殺死雄配子的效果，表現為花藥干癟、花粉粒無生活力。一般在現蕾初期和開花初期的棉株上，各噴一次配制好的殺雄劑水溶液，便可達到殺死雄配子的效果。之后開放的花朵，因雄蕊不育，不需去雄，只需授以父本花粉即可。但上述藥劑均存在某些不足，主要問題：一是殺雄效果不夠穩定。因棉花現蕾和開花時期長，藥劑使用時間和藥效持續時間較難掌握，難以使棉花的所有花朵均雄性不育；二是準確的藥劑用量較難掌握。濃度不當，往往引起藥害或殺雄不完全；三是化學藥劑可能存在環境污染的風險。化學殺雄法生產棉花雜交種因缺乏有效的殺雄劑和需要多次噴施殺雄劑（棉花花期時間長）致使棉花整株不育，至今沒有在生產上有效使用。一旦找到有效的化學殺雄劑，化學殺雄法制種將是一種經濟的制種方法。

1.3 利用雄性不育的“兩系法”和“三系法”制種

1.3.1 利用核雄性不育的“兩系法”制種 兩系法是指利用棉花細胞核雄性不育的制種方法。這種棉花雄性不育是受核基因控制，如，中國洞A不育系的雄性不育是受1對核隱性基因msms控制，可被含MSMS的恢復系恢復育性，這種核不育系與相應恢復系雜交而生產雜交種子的方法，稱為“兩系法”制種。在生產上核不育系與恢復系間隔種植，可依賴于傳粉媒介（如：蜜蜂）自然傳粉，也可人工輔助授粉，或者自然傳粉與人工授粉結合，從不育系上獲得雜交種子。但核雄性不育的保持（即，不育系的繁殖），較麻煩，這由其遺傳特性所決定。如以洞A不育系為母本（msms），與恢復系（MSMS）雜交，所得雜種F1的基因型為MSms，自交產生的F2群體會有育性分離，即可育的MSMS和MSms植株，以及不育的msms植株，其分離比例為1﹕2﹕1。不育系的繁殖就是利用MSms植株的花粉，與msms不育株雜交，讓其后代分離出一半的可育株（MSms）和一半的不育株（msms），每年如此操作來繁殖不育系種子。不難看出，其中的不育系種子（約占50%），一方面供雜交棉制種所需，另一方面供不育系繁殖所需，起到“一系兩用”的作用。

從不育系繁殖田中得到的種子，在基因型上有MSms和msms 2種類型，制種時它們被播種在制種田的不育系行中，旁邊播種恢復系（MSMS）行。臨近開花時，不育系行中，需要剝蕾鑒別出可育與不育株，以便拔去50%的MSms植株，保留另外50%的msms植株用于制種。經上述操作去掉可育株后的制種田中，只有msms和MSMS 2種基因型，即：不育系和恢復系棉株，這樣不育系只能從恢復系中得到花粉，制成的雜交棉種子的純度是高的，否則，因去除可育株不徹底，雜交種子中會混雜不育種子，影響雜交棉的產量。

兩系法制種的優點是恢復系來源廣泛，有利于選配強優組合，更換組合也相對容易。但也存在不足，如：在制種時，需要鑒別可育株和不育株，以拔除50%左右的可育株，造成人工、肥料、農藥等的浪費，且降低了制種母本的種植密度。

1.3.2 利用細胞質雄性不育的“三系法”制種 三系，即不育系、保持系和恢復系，是利用棉花細胞質雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）進行雜交種子生產（制種）的體系。棉花細胞質雄性不育，與1.3.1所述的核雄性不育不同，除了受核基因控制外，還受細胞質基因控制，是質核互作的不育，其育性既可被保持系保持（不育系的繁殖），也可被恢復系恢復（雜種F1的制種）。通常，不育系、保持系和恢復系的基因型分別用S（rfrf）、N（rfrf）和S（RfRf）或N（RfRf）表示，其中，S和N分別表示不育和可育細胞質基因型，rf和Rf分別表示不育和可育的核基因型。在不育系的繁殖田中，不育系與保持系按比例（如4﹕1）間隔種植，通過自然傳粉或人工授粉，不育系獲得保持系的花粉而收獲的種子即為不育系；而在制種田里，不育系與恢復系也按適當比例間隔種植，也通過自然傳粉或人工授粉，不育系從恢復系獲取花粉后所結的種子即為雜交種子。這種雜交種子的生產方式被稱為“三系法”制種，制種獲得的雜種常被稱為“三系雜交棉”。與“兩系法”比較，“三系法”制種的優點是不育系繁殖方便，克服了在制種時需要拔除50%左右可育株的缺陷。

棉花細胞質雄性不育的研究始于美國。20世紀60年代，具有異常棉（WaWara & Peyr）和亞洲棉（L.）細胞質的雄性不育類型分別被育成，但由于育性不穩定，沒有實現三系配套。20世紀70年代，MEYER[1]育成和發放具有哈克尼西棉（Brand.）細胞質的雄性不育系，但由于恢復系存在恢復力不強和制種產量低等的缺陷，較難實現三系雜交棉種子的產業化。浙江大學王學德等[2]用轉基因技術將一個延緩細胞衰老的谷胱甘肽S轉移酶（glutathione S-transferase，GST）基因導入待改良的恢復系中，于2000年育成一個轉基因強恢復系——浙大強恢，克服了恢復系對不育系恢復力不強的缺陷，現已廣泛應用于三系雜交棉的育種研究。

在上述棉花雜種優勢的利用途徑中，人工去雄授粉制種將隨著勞動力價格的提高逐漸被淘汰，化學殺雄法制種尚需研制殺雄劑，只有基于雄性不育的制種才是更可行的途徑。為此，本文重點對棉花細胞質雄性不育的細胞學、遺傳學和分子生物學的特點，以及三系雜交棉制種等技術問題進行闡述或討論。

2 棉花細胞質雄性不育的特點

2.1 不育花器的特點

2.1.1 不育花器的形態特征 棉花細胞質雄性不育系的花朵均比保持系和恢復系的花朵小，其雄蕊的花絲短，花藥小而干癟，用手指捻碎花藥，無花粉粒可見。從表型上很易辨別不育株和可育株。經觀察[3]，與保持系和恢復系比較，不育系的花藥體積分別小77.55%和77.73%，鮮重輕67.18%和63.34%，柱頭長度短9.31%和26.7%，受精前胚珠體積小40.96%和52.77%。

2.1.2 不育花藥的生化特征 經測定[3]，與可育花藥比較，不育花藥主要有如下特點：（1）淀粉含量極顯著減少，淀粉酶同工酶缺失和酶活性降低。（2）脂肪含量明顯偏低和酯酶同工酶缺失。（3）蛋白質含量低及其氨基酸組成異常，如脯氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸含量明顯降低。（4）內源激素含量異常，表現為吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）和玉米素核苷（ZR）偏低，而脫落酸（ABA）偏高。（5）活性氧產生速率上升，H2O2和MDA含量增多，而超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶和細胞色素氧化酶活性降低。尤其值得關注的是上述不育花藥的生化異常主要發生在小孢子母細胞減數分裂時期。

2.2 不育花藥的細胞學特點

以保持系花藥為對照，在顯微鏡下觀察不育花藥的細胞形態，可發現如下特點[4]。

2.2.1 小孢子母細胞減數分裂的異常 早在造孢細胞增生和增大期，不育花藥中可普遍觀察到比可育花藥明顯多的含2—3個微核的造胞細胞。其中，有些造孢細胞增大體積后形成的小孢子母細胞沒有進入正常的減數分裂，而是以有絲分裂方式形成比正常小孢子母細胞明顯小的細胞且逐漸壞死。即使有的造孢細胞能形成小孢子母細胞，但也不能進行正常的減數分裂，如在中期，當大多數染色體排列在赤道板時，尚有個別染色體落后散布于赤道板外面；又如在后期，染色體運動至兩極后，染色體未集中于兩極，而是凝結成若干個大小不一的團塊散布于兩極。

因此，棉花細胞質雄性不育，最明顯的特點是發生早，早在小孢子母細胞形成及其減數分裂時期就出現異常，使不育花藥內不能形成小孢子（花粉），致使棉花細胞質雄性不育很穩定，不受外界環境的影響。

2.2.2 絨氈層細胞的過早退化 不育花藥在小孢子母細胞敗育的同時，絨氈層細胞的退化也十分明顯。在花藥內形成造孢細胞以后，藥壁有3層細胞，即表皮層細胞、過渡層細胞和絨氈層細胞，此時不育花藥的絨氈層細胞在大小上與可育花藥的絨氈層細胞無明顯差異，但細胞已開始液泡化，染色較淺。隨著小孢子母細胞增殖，過渡層細胞經一次平周分裂，藥壁細胞已有4層，即表皮層、藥室內壁、中層和絨氈層。這時，可育花藥的絨氈層細胞不但大而染色深，常含有雙核；相反，不育花藥的絨氈層細胞趨向停止分裂和生長，不但體積很小（與中層細胞的大小相近），而且往往高度液泡化，在細胞形態學上與可育花藥的絨氈層細胞形成十分明顯的對比。在不育花藥內，小孢子母細胞退化解體后，絨氈層細胞在功能上不再為小孢子起運輸和同化營養物質等功能，而細胞徑向分裂和膨大充塞整個花粉囊室，室中間只留下壞死的小孢子母細胞的痕跡，形成無花粉粒的不育花藥。

因此，在棉花細胞質雄性不育花藥內，小孢子母細胞的敗育與絨氈層細胞的過早退化密切相關。

2.3 雄性不育的遺傳特點

目前，棉花細胞質雄性不育最有利用價值的是具有哈克尼西棉細胞質的雄性不育，它是陸地棉的細胞核與哈克尼西棉的細胞質相互作用引起的雄性不育，也可以說是異源的質-核不親和性而產生的雄性不育。由此可見，研究哈克尼西棉細胞質雄性不育的遺傳特點，不但要研究細胞核中的育性基因，還要研究細胞質中的相關基因，以及這兩類基因的相互作用。為此，王學德等[5-6]自1988年起，對該不育系的核基因和細胞質基因進行了分析。

2.3.1 核基因——恢復基因和育性增強基因的遺傳特點 以8個棉花細胞質雄性不育系（A）和保持系（B），以及6個恢復系（R）為材料，通過雜交、自交、回交和測交，獲得55種類型的研究群體；其中，NCⅡ交配獲得的（A×R）F1及其F2各有27個組合，回交獲得的（A×R）F1×B和A×（A×R）F1共有19個組合，等位性測驗群體（At×R）F1×（Ack×R）F1有9個組合（At為待測不育系，Ack為對照不育系）。通過對各群體育性的遺傳分析（孟德爾式），發現棉花細胞質雄性不育系育性恢復的遺傳可概括為以下幾個特點：

（1）不育系的育性恢復受2個獨立的顯性基因（Rf1和Rf2）控制，Rf1和Rf2稱為恢復基因，其中，Rf1為完全顯性，Rf2為部分顯性，Rf1對育性恢復的遺傳效應大于Rf2；Rf1和Rf2對不育系的育性恢復起主導作用，但育性恢復的程度可被一個稱為育性增強基因（E）所促進；E與Rf1和Rf2無連鎖，但存在互作。這一遺傳模式，與前人對哈克尼西棉細胞質雄性不育的遺傳研究有所不同。MEYER[1]報道育性恢復受2對獨立遺傳基因控制，其中一對是顯性基因（F-），另一對是純合隱性基因（ss）。WEAVER等[7]和SHEETZ等[8]則認為育性恢復是受1個部分顯性基因（Rf）控制，但在育性分離世代中常出現比例偏離期望比例的現象，在個別雜交組合的分離世代群體中，還有2對基因控制的表型分離比例。顯然，棉花細胞質雄性不育的遺傳較復雜，使上述研究結果不甚一致。也有可能研究者在育性鑒定標準上存在差異；因為在育性分離世代中，有些棉株的花藥雖有花粉但育性很低，與不育（無花粉）花藥較難區分，這時有可能將那些弱育性可育株錯歸為不育株，使其研究結果不準確。

（2）由于恢復基因與育性增強基因的作用不同，在棉花細胞質雄性不育及其恢復的系統中，存在2個不同的概念，即恢復性和恢復度；恢復性是指不育系與恢復系雜交恢復基因抑制雄性不育的表達使F1表型呈可育的特性，而恢復度是指育性增強基因促進恢復基因的表達使F1育性顯著提高的量。而育性增強基因往往存在于海島棉中，因為陸地棉不育系與海島棉恢復系雜交，或海島棉不育系與陸地棉恢復系雜交，其雜種F1的花粉育性有明顯提高[8-10]。

另外，觀察還發現：

（1）不育系的保持系來源較廣，陸地棉和海島棉類型品種均可作不育系的保持系，這對于培育陸地棉和海島棉類型不育系[10]以及配制海陸雜交種[9]提供了十分有利的條件。

（2）恢復系來源較窄，且存在恢復能力較弱的問題。大多數恢復系與不育系雜交產生的F1，由于有部分花粉生活力弱，當天氣干旱和高溫時，結鈴率偏低和不孕籽率較高，影響雜交棉的產量和品質[10-11]。因此，選育強恢復系在三系雜交棉育種中尤為重要。

2.3.2 細胞質基因——線粒體基因的變異 王學德等[12]和蔣培東等[13]以哈克尼西棉細胞質雄性不育系和保持系花藥為材料，分別提取線粒體DNA和蛋白質，進行DNA測序分析和蛋白質SDS-PAGE分析，發現不育系線粒體基因及其表達產物存在明顯的變異，主要有以下2點：

（1）與保持系比較，不育系的線粒體基因——細胞色素氧化酶（cytochrome oxidase，COX）基因有5個堿基發生了突變，A184、C255、A366、C442和G516分別被替換為C、T、C、A和C，從而使不育系推導的氨基酸Ser62、Lys122、Thr148分別被Arg、Asn和Asn替代，而Ser85和Leu172因存在密碼子簡并現象未發生變化，不育系在上既發生了錯義突變又發生了無義突變。這表明棉花細胞質雄性不育與線粒體基因的變異有關，鞏養倉等[14]也有相似的推測。

（2）不育系線粒體中的31 kD蛋白質只有在花藥中缺失，而在黃化苗中仍存在，這表明棉花細胞質雄性不育基因的表達具有嚴格的時空順序。例如，反映在細胞形態學上不育系的敗育時期是在造孢細胞增殖至小孢子母細胞減數分裂時期，敗育的空間是在小孢子母細胞和絨氈層細胞。因此，研究植物雄性不育基因的表達選擇合適的研究材料（如敗育時期的花藥）是重要的。

線粒體存在于真核生物的所有細胞中，提供細胞內生命活動所需的大部分能量，同時又是TCA循環、氧化磷酸化及脂肪氧化的細胞器。線粒體在遺傳上有自主性，含有一套能自我復制、轉錄和翻譯的基因組。但線粒體中的大部分蛋白質是由核基因編碼的，只有約10%的蛋白質是由線粒體基因編碼。因此，質-核關系的協調或親和性對線粒體執行正常功能是必需的。棉花細胞質雄性不育是通過將四倍體陸地棉的核置換到二倍體哈克尼西棉的細胞質中引起質-核不親和性而產生。在本研究中，對不育系線粒體DNA及其蛋白質的分析，所顯示出的變異可能涉及線粒體功能的失調，這種失調也可能是哈克尼西棉細胞質與陸地棉細胞核間的不親和性所致。當不育系與恢復系雜交，F1被引入恢復基因后，線粒體蛋白質恢復正常，說明恢復基因產物可彌補不育系線粒體的缺陷。

2.4 不育細胞質對雜種F1的效應

棉花不育細胞質對雜種一代的遺傳效應是棉花細胞質雄性不育能否成功地應用于雜交棉生產的重要問題，一直受到棉花育種工作者的高度關注。為此，王學德等[15]組配3類雜種，即S（A×R）F1、S（R×B）F1和N（B×R）F1，進行3次重復的隨機區組比較試驗，記載了雜種的農藝性狀和花藥育性性狀，以便在相同核背景和育性恢復的條件下比較不同細胞質（不育細胞質S和可育細胞質N）對F1的效應。

2.4.1 不育細胞質對雜種F1花藥育性的效應 具有不育細胞質的雜種S（A×R）F1和S（R×B）F1，雖然花藥育性趨向正常，但花藥內花粉的可育程度仍不及可育細胞質雜種N（B×R）F1，不育細胞質（S）雜種的平均可育花粉率（85.12%）比可育細胞質（N）雜種（89.15%）低4.39%。尤其反映在自交結鈴率上的差異更明顯，不育細胞質雜種的自交結鈴率比可育細胞質雜種低26.14%，而且不孕籽率上升10%左右。

觀察還發現，不育細胞質對F1的效應明顯反映在花藥的形態性狀和生化物質含量上。與可育細胞質雜種比較，不育細胞質雜種的平均每粒花藥體積小0.90 mm3，每百粒花藥干重輕3.1 mg，分別達極顯著和顯著差異；鮮花藥內的可溶性蛋白質含量低4.06 mg·g-1，差異顯著，但可溶性糖和淀粉含量在兩類雜種間差異不明顯。

2.4.2 不育細胞質對雜種F1產量和品質的效應 同樣利用上述的3類組合，進行3次重復的隨機區組比較試驗，記載其產量和品質性狀，結果表明，不育細胞質對F1產量性狀具有明顯負效應。其中，對皮棉產量的影響最大，與可育細胞質雜種相比，不育細胞質雜種平均產量下降84.06 kg·hm-2，差異顯著（=0.05）；其次，是鈴數和衣分分別下降0.66個/株和1.12%，而鈴重在2種組合間差異不明顯。不育細胞質對F1纖維品質效應不十分明顯，而且2種組合間的差值有增也有減，無明顯規律性變化，但從平均數上看，纖維長度有下降趨勢，整齊度、比強度和馬克隆值則有上升趨勢。

趙存鵬等[16]研究表明冀2658A的不育細胞質對F1的效應主要表現為衣分顯著降低（比對照組低1.61%）、黃萎病抗性增強（黃萎病指數比對照組低18.29%）和棉籽中的粗脂肪含量降低（比對照組低2.88%）。

3 外源GST克服不育細胞質的負效應

3.1 克服不育細胞質負效應的策略

不育細胞質對雜種有負效應，尤其在高溫或低溫脅迫條件下[11]，雜種花粉活力較低，從而引起三系雜交棉（F1）結鈴率較低和不孕籽率較高。主要有2方面原因：其一是棉花細胞質雄性不育系敗育時期過早（減數分裂時期敗育）；其二是恢復系的恢復力不夠強。從遺傳角度分析，這一現象實際上是恢復基因不能徹底抑制不育基因所至。克服這一缺陷，雖然可從推遲不育系敗育時期著手，但這不利于不育系的育性穩定性，因為敗育時期早是育性穩定的有利條件，這一優點應保留。所以，最好從提高恢復系的恢復力著手，引入強恢復基因或育性增強基因。即，提高三系雜交棉花粉育性。從育種角度分析，就是要提高恢復系的恢復力，徹底抑制雜種中不育細胞質的效應。從細胞生物學角度分析，三系雜交棉花粉生活力低是雄性細胞發育不佳，過早衰老的表現。細胞衰老常伴隨細胞氧化，細胞氧化常由過多活性氧積累所致。因此，三系雜交棉通過引入抗氧化基因，抑制雄性細胞活性氧積累，對于進一步改良其花粉育性具有重要意義。

3.2 GST的抗氧化功能

谷胱甘肽S轉移酶（glutathione S-transferase，GST）是一種抗細胞氧化的酶，在提高細胞膜的修復能力和延緩細胞衰老具有重要功能，常被認為是一種抗逆性酶。在植物中，除草劑、病原微生物、重金屬離子、鹽脅迫、高溫、冷害、機械損傷等都會誘導的表達。外源轉化植物后常表現為GST的優勢表達，能提高植株的抗逆境能力。VIGINA等[17-18]將一個具有GST酶活性的基因導入煙草后，發現轉基因植株抗冷害和抗鹽害的能力明顯增強，進一步研究表明，外源是通過優勢表達，提高轉基因植株GST酶活性，從而保護其他抗氧化酶，進而提高轉基因植株的活性氧清除能力，防止逆境條件下氧應激的產生和膜脂過氧化。YOUSUKE等[19]從煙草葉肉組織中克隆到一個受生長素（IAA）誘導的——。據研究屬φ類（植物GST酶可分為φ、τ、θ和ζ四類），具有很強的抗氧化能力。BUNICHI等[20-21]將導入擬南芥，發現優勢表達的轉植株能顯著提高由重金屬和H2O2誘導氧應激的抵抗能力。

植物細胞質雄性不育常與線粒體基因的突變有關，而線粒體基因突變常引起線粒體膜受損和功能的失常，以及活性氧異常積累，乃至細胞衰亡。這種受損首先發生在雄性細胞中，因為它比其他細胞受環境的影響更敏感。由于三系雜交棉（F1）含有不育細胞質，如果核恢復基因的效應不夠強，不能完全修復不育細胞質中的線粒體功能缺失，或不能完全消除活性氧毒害，就有可能影響花粉的育性，導致部分花粉生活力的降低，這是以往三系雜交棉存在的問題。為克服現有恢復系對不育系恢復力不夠強的缺點，王學德等[2-3]用根癌農桿菌介導法，將一個具有抗逆性能的谷胱甘肽S轉移酶基因（）導入恢復系，育成一個對不育系具有強恢復力的恢復系——浙大強恢，以提高三系雜交棉花粉育性。

3.3 GST促進雜種F1的花粉育性

3.3.1 外源對三系雜交棉（F1）花粉育性的促進作用 以受體恢復系0-613-2R和DES-HAF277為對照，浙大強恢分別與3個不育系HA277A、中12A和抗A雜交，用甲萘酚-聯苯胺染色法測定8個組合的F1可育花粉率，統計杭州和三亞兩地數據。數據顯示，以浙大強恢為父本與不育系雜交，其F1的可育花粉率達92.12%，比以0-613-2R和DES-HAF277為父本的F1可育花粉率分別提高15.2%和25.80%，達顯著和極顯著水平。另外，從花器的表型也可明顯看出，（抗A×浙大強恢）F1比對照（抗A×0-613-2R）F1和（抗A×DES-HAF277）F1的花器要大，且花藥大，花粉多，散粉好。浙大強恢的恢復力比原2個受體恢復系有顯著提高，表明對不育系的育性恢復有促進作用。

3.3.2 外源對三系雜交棉（F1）產量的促進作用 用浙大強恢配制的7個組合雜種種子，進行5個地點3次重復的比較試驗，篩選出1個最好的三系雜交棉組合浙雜166。該組合在5個點的平均皮棉產量為1 173.0 kg·hm-2，比推廣良種泗棉3號增產10.6%，其中，有1個地點的增產達21.2%。試驗還表明，浙雜166單株結鈴數比對照多3.6個，單鈴重增加0.6 g，特別是不孕籽率顯著降低10.1%。由于浙大強恢對不育系具有強的育性恢復力，用它配制的雜種F1（浙雜166）花粉育性得到極顯著提高，從而有利于結籽率和結鈴性的提高，也間接提高了單鈴重。除了比強度較差外，纖維品質其他指標與對照無顯著差異。

另外，由于浙大強恢花藥散粉好，使它的制種產量也有明顯提高。例如，在浙江的杭州、金華、蘭溪、紹興、寧波等制種田中，不育系與恢復系按2—4﹕1間隔種植，借助天然傳粉媒介，配適當的治蟲等田間管理措施，不育系花柱能得到較豐富的恢復系的花粉，從而獲得較高的制種產量，與恢復系種子產量無顯著差異。

3.3.3 外源對三系雜交棉（F1）的生理生化效應 為進一步檢測外源引入三系雜交棉后的生理生化效應，朱云國[22]測定浙大強恢所配強育性F1和DES-HAF277所配弱育性F1等4個材料的根、莖、葉和花藥的表達水平，以及所引起的一些生化指標。結果顯示，外源在花藥中比在其他器官中有優勢表達的特點。浙大強恢所配F1花藥的轉錄量比受體恢復系DES-HAF277所配F1花藥高1.6倍，均達極顯著差異。外源的導入，除了使雜種F1花粉育性提高外，還會引起其他生理生化性狀的明顯變化（一因多效）。表現為花藥活性氧（O2.-和H2O2）產生速率的極顯著降低，抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD、過氧化氫酶CAT、抗壞血酸過氧化物酶APX）活性、呼吸速率和抗氰呼吸等指標的明顯提高。

3.3.4 外源克服不育細胞質負效應的可能機理 外源導入恢復系后，育成轉恢復系——浙大強恢，通過與不育系雜交，引入外源于三系雜交棉（如浙大166）中，使優勢表達，提高三系雜交棉花藥的GST酶活性，促進活性氧的清除，防止逆境條件下氧應激的產生和膜脂過氧化，從而有效保護花粉的育性，克服由于花粉育性偏低而引起的結鈴率低和不孕籽率高的負效應。根據這一現象，提出了棉花細胞質雄性不育與育性恢復的可能機理（活性氧假說）[2,13,22]。

4 三系雜交棉的制種

4.1 三系雜交棉的親本——不育系和恢復系

三系雜交棉的育種關鍵是親本選配，選擇能產生強優勢的2個親本——不育系和恢復系，通過雜交獲得比當地推廣品種顯著增產和優質的雜交組合。育種實踐表明，優良的不育系和恢復系應該符合以下要求。

4.1.1 對不育系的要求 細胞質雄性不育是由保持系保持的，換言之，不育系的繁殖是由保持系提供花粉實現的。因此，一個穩定的不育系是以保持系為輪回親本通過反復回交而獲得的，其細胞核與保持系基本相同；即，有什么樣的保持系，就會有什么樣的不育系。目前，陸地棉或海島棉品種（系）均可用作棉花細胞質雄性不育系的保持系[3,9-10]。當選育成一個優良保持系后，通過與不育系反復回交5次以上，獲得的不育系應符合以下標準：

（1）田間群體性狀穩定，整齊一致。

（2）不育度100%，花藥內無花粉或花粉全敗育，且不育性穩定，不受地點和氣候條件等環境因素的影響，群體不育株率100%。

（3）開花習性好，花器大，柱頭明顯高出雄蕊，利于昆蟲授粉，也便于人工輔助授粉。

（4）異交率要高。因棉花是以自花授粉為主的常異花授粉作物，不育系本身不產生花粉；在自然條件下（不采用人工輔助授粉），主要依靠昆蟲傳粉，接受保持系或恢復系花粉才能結種子。因此，那些具有吸引昆蟲（尤其是蜜蜂[22-23]）造訪的花朵蜜腺、顏色和氣味等特性的不育系，更有可能獲得高的異交率。異交率高，不育系不但能得到花粉的機率高，而且得到的花粉的量也多，從而使結鈴率提高和不孕籽率降低，最終獲得較高的制種產量，同時也可有較高的皮棉產量。

（5）可被恢復性好。通過與恢復系雜交獲得的雜種（F1）花粉育性好，且不隨環境條件改變而發生花粉育性大的波動，結鈴性好，不孕籽率低。

（6）配合力強。不育系與恢復系的配合力直接決定三系雜交棉的優勢水平，在各種性狀配合力選擇中，除了選擇產量、品質和抗性的特殊配合力高的不育系，也應注重選擇一般配合力強的不育系。因為一般配合力好的不育系，與不同恢復系分別雜交，產生優勢組合的機會更多。

（7）綜合性狀好。育成的不育系株型以塔型較好，葉大小適中，中下部不郁閉，通風透光性好；這樣有利于昆蟲造訪，也便于人工輔助授粉。對生產上的主要病蟲害具有較好的抗性，尤其是對枯萎病和黃枯萎病，以及棉鈴蟲和紅鈴蟲的抗性突出。棉纖維品質優良。

4.1.2 對恢復系的要求 有了優良的不育系和保持系，還必須有優良的恢復系才能配制出豐產、優質、抗病、抗蟲的組合，一個優良恢復系應具備以下幾點：

（1）基因型應為S（RfRf）或N(RfRf)。不過，為選育方便，大多采取前者基因型。因為在恢復系種植過程中可能會引起生物學污染（非恢復系花粉傳入），這時S（RfRf）因外來花粉污染會使其基因型轉變成S（Rfrf），次年會分離出不育株，從而通過發現不育株可確認恢復基因的流失（Rf變為rf）；但是，N（RfRf）基因型在種植過程中若發生恢復基因流失，在表型上是不能發現的，因為它的細胞質是可育型（N）。

（2）如果恢復系基因型是S（RfRf），要求恢復基因（Rf）效應大，即雄蕊表現為花絲較粗長、花藥大、散粉多的單株。

（3）恢復力要強。恢復系的恢復力是通過與不育系雜交，從F1花藥的育性或植株的結鈴率表現出來的。凡是恢復系具有強的恢復力，由它配制的雜種F1，花藥大、散粉好、結鈴率高，達到大田生產的要求，而且受環境條件的影響很小。

（4）具有標記性狀，便于去雜保純[24]。在基因型上，恢復系S（RfRf）不同于保持系N（rfrf），但在表型上，兩者幾乎是一樣的，難以區分。為了從表型上能觀察到S（RfRf）與N（rfrf）間的明顯差異，避免混雜（如：田間種植時的生物學污染，曬花軋花時的機械混雜），恢復系最好帶有標記性狀。標記性狀應易于肉眼觀察，且是隱性或不完全顯性基因控制的性狀（如：無腺體、雞腳葉等）。例如：用無腺體標記的恢復系，因無腺體是受2個隱性基因（glgl）控制的性狀，當恢復系繁殖田中混入有腺體植株（GlGl/GlGl）時，或傳入有腺體花粉（GlGl）時，在當代或下代就可看到雜株（有腺體）的混入，只要將雜株拔除就可保持恢復系純度。由此可見，此處的標記性狀起到了指示恢復系“真”或“偽”的作用，在三系雜交棉制種和繁種的生產過程中保證種子的質量（種性和純度）具有重要意義。除了用形態性狀來標記恢復系外，也可用DNA分子標記來標記恢復系[25]。

（5）配合力要強。恢復系的配合力也是通過其雜種F1反映出來。要求它與不同不育系配組合，能表現出強的一般配合力和特殊配合力。一般配合力強表明某個恢復系與群多不育系雜交均能表現出強的雜種優勢；相對應地，特殊配合力強說明該恢復系只與專一不育系雜交才顯示出強的雜種優勢。顯然，一般配合力強的恢復系被應用更廣，價值更高。

（6）農藝性狀好。恢復系除了有強的恢復力，綜合農藝性狀好對于選配強優勢組合很重要，關系到三系雜交棉的高產、優質和抗性。一般來說，一個強優勢組合，親本之一往往為高產親本，另一親本是優質親本或抗逆親本。所以，恢復系的農藝性狀要接近目前推廣的常規品種，使主要經濟性狀，如：結鈴率、每畝總鈴數、鈴重、衣分、纖維品質和抗病蟲等性狀，要與不育系性狀互補。

（7）與不育系有較大的遺傳差異。雜種優勢的強弱與雙親細胞核的遺傳差異大小存在一定的相關性。一般而言，在一定范圍內不育系與恢復系間的遺傳差異愈大，其雜種一代的優勢就愈強，反之，優勢就不會很明顯。

4.2 三系雜交棉的制種

有了優良的不育系和恢復系，通過大量配組（配制雜交組合）和篩選便可獲得強優組合——三系雜交棉，其2個親本——不育系和恢復系便可用于制種。三系雜交棉制種一般要求如下[3]：

4.2.1 選擇棉花異交率高、隔離條件好的棉田

棉花是常異花授粉作物，花粉粒較大，直徑超過120 μm，不易借助風力傳粉，主要借助昆蟲傳粉。棉花田中的傳粉昆蟲約有20余種，其種類和數量隨環境條件的變化而變化，使棉花的自然異交率變幅很大。通常，棉花的自然異交率為3%—10%，有時，異交率可達20%—50%。在一些特定條件下，若傳粉媒介豐富，甚至高達80%。要提高三系雜交棉的制種產量，即從不育株上獲得更多的種子，必須人為地提高不育系與恢復系間的異交率。這時必須選擇棉花異交率高、隔離條件好的棉田。一般應符合以下條件：

（1）隔離條件

周邊無棉花種植 制種田周邊無其他棉花種植是最好的自然隔離條件，也是最簡單的隔離措施。一般選擇非植棉區的田塊進行制種，可保證三系雜交棉的種子純度。若一定要在棉區制種，也應保證在制種田周邊2 km內無棉花種植。

用非蜜源植物隔離 這是考慮到蜜蜂采蜜有喜好性。蜜蜂對棉花蜜源雖有喜好，但不是最喜好。為迫使蜜蜂集中于不育系與恢復系花朵間傳粉，在制種田附近應該沒有比棉花更能吸引蜜蜂的蜜源植物，否則，蜂群因喜好，放棄棉花而去造訪其他植物。

用紗網隔離 紗網是指能阻止昆蟲穿過但能通風透光的尼龍網。用紗網隔離的優點是被隔離的棉花不受外界傳粉媒介的影響，適合于在棉區進行小規模的制種，或制種比較試驗[26]。例如，因科研需要，制種組合多、而所需種子量不多的情形，可用紗網隔離成若干網室進行制種。但這種隔離成本較高；另一方面，因網室內通風透光較差對棉花生長發育有一定影響，而且對一些小昆蟲的隔離不一定有效。為此，選擇適當網孔大小是值得考慮的因素。

（2）提高異交率條件

在與其他棉花隔離條件下，提高制種田中不育系與恢復系的異交率，是保證制種產量較高的關鍵。因此，選擇高異交率的地點，是布置制種田的指導思想。

在村莊附近 很多村莊有養蜂的習慣，或曾經養過蜂，使周邊有較多的家養或野生蜜蜂。選擇此類村莊的附近的田塊作為三系雜交棉的制種田是可行的。但此類村莊往往有較多的蜜源植物，為了避免制種田中的蜜蜂被它吸引走，還需要選擇相對較少蜜源植物的村莊為佳。或者，棉花開花期與其他蜜源植物的泌蜜期（開花期）適當錯開。例如，大多數果樹開花期早于棉花，待蜜蜂對前者采蜜結束后轉入棉花采蜜，是棉花借助蜜蜂傳粉的合理選擇。

在水源附近 一般池塘、溪、河邊的田塊較濕潤和涼爽，不但有利于棉花生長和發育，也是適宜蜜蜂活動，在這類田塊上制種往往產量較高。

晝夜溫差較大的地點 棉花泌蜜屬于高溫型，泌蜜適溫為35℃左右，晝夜溫差大泌蜜更多，更適合放養蜜蜂采蜜和傳粉。如在新疆吐魯番，降雨量少，晝夜溫差相當大，有利于棉花的有機物質的積累，因而泌蜜量很多，棉花蜜產量高而穩定，單產可達150 kg。在此類地方實施養蜂與制種相結合的生產，可獲得制種和產蜜的雙重經濟效益。

沙質中性土 棉花泌蜜受土壤條件影響最大，土壤性質不同，泌蜜量也不同，這與吸引蜜蜂傳粉有關。棉花生長在沙質中性土，泌蜜豐富。在粘質土和紅、黃壤上，蜜少或無蜜。因此，選擇有利于棉花泌蜜的土壤作為制種田，對借助蜜蜂傳粉提高不育系與恢復系的異交率也有一定的促進作用。

4.2.2 選擇異交率高的不育系和恢復系

（1）蜜腺發達

不育系和恢復系，尤其是不育系，若有發達的蜜腺，有利于引誘昆蟲，有利傳粉，是提高三系雜交棉制種產量的重要因素。陸地棉花冠在開花時張得很開，似喇叭狀，而海島棉開得象管狀喇叭。經觀察，陸地棉花朵對蜜蜂的吸引力比海島棉更強[3,22]。若在制種田放蜜蜂進行自然授粉，海島棉需要更多的蜂只數。

（2）不育系柱頭高出雄蕊和恢復系花藥散粉好

不育系柱頭，有的與雄蕊齊平，有的明顯高出雄蕊。顯然，不育系柱頭突出于雄蕊，可使蜜蜂等昆蟲身上帶的花粉便于散落在柱頭上，而且人工授粉也方便和充分。不育系雌蕊雖偏小，但功能正常，它的柱頭只有在被授粉后，子房才能發育成棉鈴，胚珠才能發育成種子。一個不育系的棉鈴，如果正常發育，常可收獲30—40粒雜種種子；但是，若授粉不充分，不育系棉鈴脫落較多，或不孕籽增多；從而使棉株營養生長過旺，引起徒長和二次生長。因此，采用各種方法保證不育系柱頭獲得充足的花粉，是三系雜交棉制種的關鍵。

恢復系是為不育系提供花粉的，因此要求恢復系花朵大、雄蕊發達、花粉多、散粉好，一方面使昆蟲帶更多的花粉；另一方面人工授粉時采一朵花可授更多的不育系柱頭。另外，恢復系必須與不育系同時開花，即：花期相遇。否則，不育系開花過早或過遲，不但使制種產量降低，而且由于不育系因沒有受精的花朵多，脫落多，結鈴少，往往引起營養生長過旺而徒長，制種田密閉，爛鈴嚴重，產量更低。

（3）株型似塔形和抗蟲

蜜蜂不喜好密閉的棉花群體，而且往往習慣采訪上部花朵。塔形的株型，使制種田棉花通透性好，一方面利于蜜蜂采訪；另一方面也方便人工授粉時尋找花朵。含有抗蟲基因（如BT基因）不育系和恢復系，可少噴農藥治蟲，尤其在盛花期盡可能不噴農藥，使蜜蜂等傳粉昆蟲能安全有效地為不育系授粉。

4.2.3 選擇適當的不育系與恢復系的種植比例和栽培技術

（1）適當的不育系與恢復系的種植比例

根據不同授粉方式，可有較大變化。若完全由自然昆蟲授粉，比例應放小，如2﹕1或4﹕1；若完全人工去雄授粉，比例就可放大，如：8﹕1或10﹕1；若自然授粉與人工輔助授粉相結合的方式，比例可為4﹕1或6﹕1等。

（2）適當的栽培技術

種植密度 為適應蜜蜂喜好，以及人工授粉的方便，不育系與恢復系的種植密度宜較稀，在土壤肥力條件好的田塊更需稀植。在授粉制種過程中，如果植株生長快，可能會造成群體密閉時，可拔去部分結鈴少的不育系植株，或授粉結束后（盛花期過后）拔去恢復系行。

播種時間 為使不育系與恢復系開花期相遇，播種日期可以錯開，如果不育系開花期較早，先播種不育系行，留出恢復系行推后若干天再播。棉花開花期較長，不會出現嚴重的花期不遇的情況；所以不育系與恢復系通常是同時播種，待開花初期再做調整，如對不育系進行整技時去掉下部無效果枝（未結鈴的果枝）。

合理施肥 為使制種田有良好的通風透光條件，應根據棉花生長發育進程，進行合理的施肥和灌水，嚴格防止徒長。尤其在棉花開花盛期，群體密閉，不但影響棉花泌蜜量和吸引昆蟲傳粉，也影響人工輔助授粉。

少噴農藥 在需要借助昆蟲傳粉時，應盡量少噴農藥，尤其在開花盛期，以減少對傳粉媒介的危害。在非棉區設置的制種田，因前茬作物不是棉花，病蟲害相對較輕，少噴農藥是可行的。即使要噴，也應避開盛花期和蜜蜂出巢期。當然，完全人工授粉的制種田，不受此限制。

種植若干蜜源作物 在棉花制種田中少量種植蜜源作物，如在恢復系行中種植幾株玉米，并使玉米開花期與棉花開花期相遇，一方面吸引蜂群；另一方面為蜂提供食物。但在制種田附近應該沒有比棉花更能吸引蜂的蜜源植物，否則，蜂群因喜好，放棄棉花而去造訪它植物。

4.2.4 選擇適當的授粉方式

三系雜交棉制種是指用恢復系花粉給不育系授粉獲得雜種一代種子的生產過程。授粉的方式主要有3種，即：昆蟲自然授粉法、人工輔助授粉法和完全人工授粉法。制種者可依據不同的生產要求和條件，采用合適的授粉方式進行制種。

（1）昆蟲自然授粉法

昆蟲自然授粉法是指完全依賴于自然傳粉媒介，不施加人工授粉的三系雜交棉制種法。如果制種地點有豐富傳粉媒介，并配以適當的措施，自然傳粉法是最簡便和經濟的方法，但也存在一定的風險。因為自然傳粉媒介（如蜜蜂）的行為是較難控制的，受到許多環境因子的影響，不能保證棉花泌蜜能完全吸引蜜蜂于制種田中。尤其海島棉，對蜜蜂的吸引力不大，借助自然傳粉的風險更大些。顯然，采用此法的關鍵措施是選擇制種地點和吸引傳粉媒介，以及合理的制種田布置和管理。

（2）完全人工授粉法

完全人工授粉法是指在缺乏自然傳粉媒介的條件下，或不育系和恢復系分別種于不同田塊，由人工將恢復系花粉授到不育系柱頭上進行制種的方法。不育系和恢復系可在同一制種田里按比例種植外，還可分別種植，也可相隔較遠的不同田塊里分別種植，授粉者每天上午采集大量恢復系花朵，并帶到不育系田（區）里為不育系授粉。

這種父母本分別種植方式有幾個優點：一是不育系與恢復系的種植比例可大大提高，如：5—10﹕1；二是人工授粉可控性好，若授粉充分和均勻，制種產量較高；三是便于田間管理，可根據不育系和恢復系的生長發育特點，分別進行管理；四是恢復系單獨隔離種植，除了為不育系提供花粉外，多余的留在恢復系上的花朵還能結純度較高的種子，起到了繁殖恢復系的作用。

完全人工授粉法制種，雖然可不必重視通過增加傳粉媒介提高父母本異交率的因素，但仍需要注意三點：一是隔離條件好，防止其它棉花花粉的傳入；二是父母本種植比例適當，避免恢復系花粉的供應量過多或過少；三是父母本花期相遇，尤其海島棉與陸地棉種間雜種的父母本因生育期相差較大，采用分期播來調節花期相遇。

（3）人工輔助授粉法

人工輔助授粉是指在自然昆蟲授粉的基礎上再輔以人工授粉，進一步為不育系增加花粉量，使不育系每朵花都能被授粉，是三系雜交棉制種值得推薦的一種方法。它彌補了完全靠昆蟲授粉的不足，因為昆蟲授粉時可能有的花朵（尤其是棉株下部陰暗面處的花朵）沒有被昆蟲采訪過，即使采訪過也不一定柱頭上的花粉量是足夠的。此時，昆蟲訪問后再輔以人工授粉，或人工授粉后再經昆蟲授粉，均可起到相互彌補的作用，是昆蟲授粉與人工授粉結合的方法，使不育系接受的花粉更多，更均勻，棉鈴發育更好，不孕籽更少，產量更高。

另外，昆蟲活動還受環境影響很大。如蜜蜂，只有在溫暖晴朗的天氣下，授粉工作才能有效、迅速地進行。若氣溫低于16℃或高于40℃，蜜蜂的飛行將顯著減少，乃至停止授粉。在風速達24 km·h-1時以上時，蜜蜂的活動大大減弱；達34—40 km·h-1時，飛翔完全停止。寒冷有云的天氣和雷暴雨，也會大大影響蜜蜂的飛行。嚴格地說，完全依賴于昆蟲自然授粉會有制種產量較低的風險。所以，當昆蟲活躍時可借助自然授粉，當不利天氣時可輔以人工授粉，以保證高的制種產量。

由此可見，人工輔助授粉法是對昆蟲自然授粉法的補充，是前面介紹的2種授粉法（昆蟲自然授粉法和完全人工授粉法）的綜合。因此，人工輔助授粉法制種田的布置和田間栽培管理可以參照昆蟲自然授粉法，人工授粉技術可參照完全人工授粉法。當然，在具體操作時，可根據實際情況作適當調整，如不育系與恢復系的種植比例，因施加了人工授粉，可比昆蟲自然授粉法中的種植比例再大些。

5 展望

生產實踐已證實，基于細胞質雄性不育的3系雜交棉，雖然存在不育細胞質的負效應，如結鈴率較低和不孕籽率較高的缺陷，但通過培育各類優良不育系和恢復系，進行大量配組與篩選，就有可能獲得優勢組合，從而克服這一負效應的。例如，王學德等[15]曾以6個不育系和5個恢復系為材料，采用NCⅡ交配設計，獲得27個組合的F1，以常規品種中12（推廣良種）作為對照，共28個材料進行3次重復的隨機區組比較試驗。結果顯示，有11個組合比對照增產或持平，占總組合數的40.74%，其中有5個組合表現出強優勢，其皮棉產量超對照13.33%—15.62%，達極顯著水平。從中可看出，不育細胞質的負效應不是絕對的，在某些情形下是有可能減輕或克服的，首先不育細胞質對來自保持系的不同核基因型有不同的親和力，有些保持系提供的核與不育細胞質有較高的親和力，表現為不育系不孕籽率較低，種子生產力較高；其次不育細胞質對F1育性的影響，不同的組合有不同的反應，有些組合的花粉育性接近正常，可滿足雙受精的需要，結鈴率較高，產量優勢得以表達。這在中國水稻細胞質雄性不育的研究和利用中，也有相似之處。據報道，野敗型、岡型和BT型等不育細胞質對子代的負效應也普遍存在，但通過廣泛測交和篩選，育成的一些高產組合里，這些負效應并不引起雜交稻產量的明顯降低，而且比推廣常規稻顯著增產，得以大面積推廣種植。

更值得關注的是，與其他作物相比，利用棉花細胞質雄性不育的三系法制種，在雜種優勢利用中具有的優點：（1）不育系為無花粉不育類型，育性不受氣候等環境的影響，可保證雜種的純度。（2）棉花開花期長達3個月，不存在制種時花期不遇的現象，制種產量有保證。（3）棉花生態適應性廣，育成的組合可在各地種植，種子產業化效益明顯。（4）可利用種間（海島棉與陸地棉間）雜種優勢。

可以預言，基于細胞質雄性不育的三系雜交棉是大有前途的，將是棉花雜種優勢利用的主要途徑。不過，中國棉花細胞質雄性不育的研究和利用起步較晚，現有的不育系和恢復系水平仍較低，有不少缺陷有待克服，需要借鑒水稻、玉米和油菜等作物細胞質雄性不育研究和利用的成功經驗，加強對棉花三系材料的研究和改良，克服不育細胞質的負效應，提高不育系的繁殖力和恢復系的恢復力，以組配出強優組合。如加強不育系的細胞質基因和恢復系的核恢復基因的研究，以及細胞質基因與核基因互作的研究。

在不育細胞質基因方面，可重點研究線粒體基因，如LI等[27]通過比較不育系、保持系和恢復系的線粒體基因組，發現不育系線粒體基因組發生了大量的替換和重排，從而產生了5—6個嵌合的開放式閱讀框（ORF），而且發現其中4個嵌合ORFs在不育系與可育系間有差異轉錄。在核恢復基因方面，ZHAO等[28]以特異性位點擴增片段測序（SLAF-seq）作為一種大規模識別新SNP的高分辨率策略挖掘棉花細胞質雄性不育的恢復基因（Rf），發現恢復系基因可能涉及20個候選基因。在細胞質基因與核基因互作方面，可通過酵母雙雜交等技術研究細胞質基因表達產物與恢復基因的表達產物的互作，雖未見報道，但是切實可行，因為已有不少研究表明，與可育花蕾比較，不育花蕾存在很多基因轉錄水平上的差異[29-31]，如果用這些差異基因的表達產物——蛋白質進行質/核互作研究，是有可能發現一些機理上的新東西。

迄今，棉花不育系和恢復系的類型仍不多，需要進一步拓寬。除了傳統育種外，還可用現代生物技術，如用CRISPR-Cas9基因組編輯技術[32-33]，（1）對現有不育系的線粒體基因組進行編輯，敲除/敲入某個（些）線粒體基因，有可能產生新的不育細胞質；（2）對現有恢復系的核基因組進行編輯，敲入多個恢復基因，有可能獲得強恢復系。當然，這些基因的表達需要通過絨氈層或花粉特異啟動子來調控，如朱永紅等[34]用絨氈層特異啟動子TA29驅動和在棉花中表達的轉基因方法，在創建不育系和恢復系方面做了嘗試。

[1] MEYER V G. Male sterility from., 1975, 66: 23-27.

[2] 王學德, 李悅有. 細胞質雄性不育棉花的轉基因恢復系的選育. 中國農業科學, 2002, 35(2): 137-141.

WANG X D, Li Y Y. Development of transgenic restorer of cytoplasmic male sterility in upland cotton., 2002, 35(2): 137-141. (in Chinese)

[3] 王學德. 三系雜交棉——棉花細胞質雄性不育的研究與利用. 北京: 科學出版社, 2011.

WANG X D.. Beijing: Science Press, 2011. (in Chinese)

[4] 王學德, 張天真, 潘家駒. 細胞質雄性不育棉花小孢子發生的細胞學觀察和線粒體DNA的RAPD分析. 中國農業科學, 1998, 31(2): 70-75.

WANG X D, ZHANG T Z, PAN J J. Cytological observation of microsporogenesis and RAPD analysis of mitochondrial DNAs for cytoplasmic male sterile cotton lines., 1998, 31(2): 70-75. (in Chinese)

[5] 王學德, 張天真, 潘家駒. 棉花細胞質雄性不育系育性恢復的遺傳基礎: I.恢復基因及其遺傳效應. 中國農業科學, 1996, 29(5): 32-40.

WANG X D, ZHANG T Z, PAN J J. Genetic basis of fertility restoration to cytoplasmic male sterile lines available in China: Ⅰ. Restorer genes and their effects., 1996, 29(5): 32-40. (in Chinese)

[6] 王學德, 潘家駒. 我國棉花細胞質雄性不育系育性恢復的遺傳基礎: Ⅱ.恢復基因與育性增強基因間的互作效應. 遺傳學報, 1997, 24(3): 271-277.

WANG X D, PAN J J. Genetic basis of fertility restoration to cytoplasmic male sterile lines available in China: Ⅱ. Interation effects between restorer genes and fertility enhancer gene., 1997, 24(3): 271-277. (in Chinese)

[7] WEAVER J B, WESVER J B Jr. Inheritance of pollen fertility restoration in cytoplasmic male-sterile upland cotton., 1977, 17: 497-499.

[8] SHEETZ R H, WESVER J B. Inheritance of a fertility enhancer factor from Pima cotton when transferred into upland cotton withBrandegree cytoplasm., 1980, 20: 272-275.

[9] 張小全, 王學德. 細胞質雄性不育陸地棉與海島棉間雜種優勢的初步研究. 棉花學報, 2005, 17(2): 79-83.

ZHANG X Q, WANG X D. Preliminary study on heterosis of interspecific hybrid cotton (×) based on cytoplasmic male-sterility system., 2005, 17(2): 79-83. (in Chinese)

[10] ZHANG X Q, WANG X D, JIANG P D, ZHU W. Inheritance of fertility restoration for cytoplasmic male sterility in a newrestorer., 2010, 9(4): 101-105.

[11] 倪密, 王學德, 張昭偉, 朱云國, 張海平, 邵明彥, 袁淑娜, 劉英新, 文國吉. 三系雜交棉花粉育性對高溫和低溫脅迫的反應. 作物學報, 2009, 35(11): 2085-2090.

NI M, WANG X D, ZHANG Z W, ZHU Y G, ZHANG H P, SHAO M Y, YUAN S N, LIU Y X, WEN G J. Reaction of pollen fertility on extreme temperature stress in CMS-based hybrid cotton., 2009, 35(11): 2085-2090. (in Chinese)

[12] 王學德. 細胞質雄性不育棉花線粒體蛋白質和DNA的分析. 作物學報, 2000, 26(1): 35-39.

WANG X D. Analyses of mitochondrial protein and DNA from cytoplasmic male sterile cotton., 2000, 26(1): 35-39. (in Chinese)

[13] 蔣培東. 棉花細胞質雄性不育機理的研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2007.

JIANG P D. Studies on the mechanism of cotton cytoplasmic male sterility [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2007. (in Chinese)

[14] 鞏養倉, 張雪林, 吳建勇, 張興平, 彭凡嘉, 張志剛, 賀云新, 梅正鼎, 周德桂, 邢朝柱. 哈克尼西棉細胞質雄性不育相關線粒體基因多態性分析. 棉花學報, 2017, 29(4): 327-335.

GONG Y C, ZHANG X L, WU J Y, ZHANG X P, PENG F J, ZHANG Z G, HE Y X, MEI Z D, ZHOU D G, XING C Z. Polymorphism analysis of mitochondrial genes associated cytoplasmic male sterility in cotton (Brandegee)., 2017, 29(4): 327-335. (in Chinese)

[15] 王學德, 潘家駒. 細胞質雄性不育陸地棉的細胞質效應. 作物學報, 1997, 23(4): 393-399.

WANG X D, PAN J J. Cytoplasmic effects of cytoplasmic male sterile upland cotton., 1997, 23(4): 393-399. (in Chinese)

[16] 趙存鵬, 王兆曉, 王凱輝, 劉素恩, 耿軍義, 郭寶生. 胞質雄性不育系冀2658A細胞質對陸地棉主要性狀的影響. 植物學報, 2017, 52(5): 560-567.

ZHAO C P, WANG Z X, WANG K H, LIU S E, GENG J Y, GUO B S. Effect of cytoplasmic male sterility on main characters of cotton., 2017, 52(5): 560-567. (in Chinese)

[17] VIRGINA P R, ROGER K S, ERIC R A, RANDY D A. Overexpression of glutathione S-transferase /glutathione peroxidase enhances the growth of transgenic tobacco seedlings during stress., 1997, 15: 988-991.

[18] VIRGINA P R, SUNDUS A L, DANIEL K G, JAMES R M, RANGY D A. Stress tolerance in transgenic tobacco seedlings that overexpress glutathione S-transferase/glutathione peroxidase., 2000, 41(11): 1229-1234.

[19] YOHSUKE T, TOSHIYUKI N. parB: an auxin-regulated gene encoding glutathione S-transferase., 1992, 89(1): 56-59.

[20] BUNICHI E, MAKI K, MASAKO K, HIDEAKI M. Different mechanisms of four aluminum (Al)-resistant transgenes for Al toxicity in., 2001, 127(3): 918-927.

[21] BUNICHI E, RICHARD C G. Expression of aluminum-induced genes in transgenicplants can ameliorate aluminum stress and/or oxidative stress., 2000, 122(3): 657-665.

[22] 朱云國. 棉花轉GST基因恢復系恢復力提高機理的研究[D]. 杭州: 浙江大學，2005.

ZHU Y G. Studies on mechanism of the restorability improvement of transgenic GST restorer for CMS-based hybrid cotton[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2005. (in Chinese)

[23] 吳翠翠, 李朋波, 曹美蓮, 劉惠民, 曹彩榮, 楊六六. 壁蜂與蜜蜂對棉花胞質雄性不育系的傳粉特性比較. 棉花學報, 2016, 28(4): 369-374.

WU C C, LI P B, CAO M L, LIU H M, CAO C R, YANG L L. Comparative study of wall bee and honeybee pollination characteristics in cotton cytoplasmic male sterile lines., 2016, 28(4): 369-374. (in Chinese)

[24] 劉英新, 王學德, 倪密, 文國吉, 趙亦靜, 華水金, 袁淑娜, 邵明彥. 四個帶有標記性狀的棉花CMS恢復系的主要農藝與光合生理特性. 棉花學報, 2010, 22(5): 448-453.

LIU Y X, WANG X D, NI M, WEN G J, ZHAO Y J, HUA S J, YUAN S N, SHAO M Y. Evaluation of cotton CMS restorers with different indicator traits for yield, quality and physiological characteristics., 2010, 22(5): 448-453. (in Chinese)

[25] 劉利彩, 郭立平, 戚廷香, 王海林, 唐會妮, 張學賢, 喬秀琴, 吳建勇, 邢朝柱. 棉花細胞質雄性不育恢復基因Rf1候選區域SSCP標記開發與候選. 棉花學報, 2018, 30(1): 12-20.

LIU L C, GUO L P, QI T X, WANG H L, TANG H N, ZHANG X X, QIAO X Q, WU J Y, XING C Z. SSCP marker development and analysis of candidate restorer gene Rf1 for cotton cytoplasmic male sterility., 2018, 30(1): 12-20. (in Chinese)

[26] 吳翠翠, 李朋波, 曹彩榮, 曹美蓮, 楊六六, 劉惠民. 棉花雄性不育系網室蜜蜂授粉技術研究. 農學學報, 2016, 6(1): 21-24.

Wu C C, LI P B, CAO C R, CAO M L, YANG L L, LIU H M. Study on honeybee pollination technology of cotton cytoplasmic male sterile lines in net house., 2016, 6(1): 21-24. (in Chinese)

[27] LI S S, CHEN Z W, ZHAO N, WANG Y M, NIE H H, HUA J P. The comparison of four mitochondrial genomes reveals cytoplasmic male sterility candidate genes in cotton., 2018, 19: 775-790.

[28] ZHAO C P, ZHAO G Y, GENG Z, WANG Z X, WANG K H, LIU S, ZHANG H S, GUO B S, GENG J Y. Physical mapping and candidate gene prediction of fertility restorer gene of cytoplasmic male sterility in cotton., 2018, 19(1): 6-17.

[29] YANG L, WU Y L, ZHANG M, ZHANG J F, STEWART J M, XING C Z, WU J Y, JIN S X. Transcriptome, cytological and biochemical analysis of cytoplasmic male sterility and maintainer line in CMS-D8 cotton., 2018, 97(6): 537-551.

[30] NIE H H, WANG Y M, SU Y, HUA J P. Exploration of miRNAs and target genes of cytoplasmic male sterility line in cotton during flower bud development., 2018, 18(4): 457-476.

[31] SUZUKI H, RODRIGUEZ-URIBE L, XU J N, ZHANG J F. Transcriptome analysis of cytoplasmic male sterility and restoration in CMS-D8 cotton., 2013, 32(10): 1531-1542.

[32] SONGSTAD D D, PETOLINO J F, VOYTAS D F, REICHERT N A. Genome editing of plants., 2017, 36(1): 1-23.

[33] ALZAHN M, LEVI L, YIPING Q. Plant genome editing with TALEN and CRISPR.&, 2017, 7: 21.

[34] 朱永紅, 李朋波, 潘轉霞, 楊六六, 夏芝, 曹彩榮, 吳翠翠, 丁霄, 侯保國. 利用Barnase和Barstar基因創建棉花雄性不育系及恢復系. 山西農業科學, 2017, 45(7): 1056-1057, 1083.

ZHU Y H, LI P B, PAN Z X, YANG L L, XIA Z, CAO C R, WU C C, DING X, HOU B G. Study on establishment male sterile lines and restorer lines of cotton by using Barnase and Barstar gene., 2017, 45(7): 1056-1057, 1083. (in Chinese)

Overview of the Study and Application of Cytoplasmic Male Sterility in Cotton

WANG Xuede

(College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058)

Cotton has significant heterosis. Hybrid cotton usually can increase production in lint yield by about 15% compared with conventional self-pollinated cultivars, and also can get obvious improvement in fiber quality, disease resistance, insect resistance, adversity resistance and photosynthetic efficiency. Among some links of cotton heterosis use, the most important link is the castration in the production of hybrid seeds. At present, there are four ways for the castration, such as hand emasculation, chemical male gametocide, nuclear male sterility and cytoplasmic male sterility (CMS). The production practice showed that use of cotton male sterility could not only simplify the hybrid seed production but also save the production cost on a commercial economic scale. In particular, the way of hybrid seed production by use of cotton CMS line, maintainer line and restorer line were the most effective way since it could overcome some disadvantages in the other ways. Therefore, in this paper, the study and application of the cotton CMS system in hybrid seed production were overviewed and some of problems currently limiting application were also addressed. At first, the genetic, cytological and biochemical characteristics of the cotton CMS were reviewed. Secondly, the positive/negative effects of sterile cytoplasm in hybrid F1were analyzed, and how to overcome these negative effects, such as pollen temperature sensitive and F1not expressing complete fertility, by developing strong restorer lines with a stronger ability for F1fertility restoration, was discussed in detail. For an example, transgenic strong restorer line could be developed by introducing the exogenous GST gene, which was assumed to have the function of enhancing pollen vitality, into some conventional restorer lines, and so that hybrids with higher heterosis could be produced by crossing this strong restorer with sterile lines. According to the characteristics of cotton as an often cross-pollination crop, this paper recommended in detail the key techniques of hybrid cotton seed production, such as rules of parent (sterile line and restorer line) selection, location selection and environment optimization for enriching native pollinators to produce more hybrid seeds. Then, the paper pointed out that compared with other crops, cotton hybrid seed production based on CMS system has four advantages in the cotton heterosis use: (1) The purity of hybrid seeds can be guaranteed because there is no pollen in anthers of cotton CMS line and its sterility is very stable and not affected by the climate and other environments; (2) The high yield of hybrid seed can be obtained since the long flowering period (about 3 months) of cotton does not result in the flowering asynchronismbetween sterile line and restorer line; (3) The wide ecological adaptability of cotton and the possibility of large-scale hybrid seed production will be benefited to popularize hybrid cotton; and (4) Interspecific heterosis between upland cotton (L.) and sea-island cotton (L.) can be used. It is predicted that the hybrid cotton production based on CMS system will be the main approach to utilize heterosis of cotton. Finally, the future works in study and application of CMS in cotton heterosis, especially in development of new sterile lines and restorer lines by use of modern biotechnology, was also discussed.

cotton; cytoplasmic male sterility (CMS); heterosis

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.08.005

2018-12-24；

2019-03-04

國家自然科學基金（31671763和31471567）、浙江省科技計劃（2017C32077）

王學德，E-mail：xdwang@zju.edu.cn

（責任編輯 李莉）