HPLC法測定鹽酸度洛西汀腸溶膠囊有關物質

徐豪丁云暉張英邱明豐

1上海交通大學藥學院 （上海 200240） 2上海上藥中西制藥有限公司 （上海 201806）

度洛西汀由美國Eli Lilly公司[1]首先開發上市，通常以鹽酸鹽的形式被使用，度洛西汀現已廣泛用于治療重度抑郁癥、廣泛性焦慮障礙、糖尿病周圍神經痛、纖維肌痛、慢性肌肉骨骼疼痛，以及婦女中至重度應激性尿失禁癥[2]。度洛西汀抑制中樞神經系統中5-羥色胺和去甲腎上腺素（NE）的再攝取。度洛西汀通過抑制去甲腎上腺素再攝取泵（NET），使多巴胺（DA）在前額葉皮質增加，而多巴胺再攝取泵很少，因而它被認為能夠介導多巴胺和去甲腎上腺素的再攝取[3]。度洛西汀對多巴胺能、膽堿能、組胺能、阿片類、谷氨酸和GABA再攝取轉運蛋白沒有明顯的親和力，因此被認為是5-羥色胺和去甲腎上腺素轉運體的選擇性再攝取抑制劑。度洛西汀代謝廣泛，但主要循環代謝產物不具有顯著的藥理活性[4,5]。

文獻資料表明，關于鹽酸度洛西汀腸溶膠囊臨床研究的文章較多，但關于其制劑產品檢驗方法的研究較少。本研究擬建立一個檢測時間短且使用的溶劑相對環保的度洛西汀有關物質的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1100及1200型高效液相色譜儀、紫外檢測器、1200型DAD檢測器（圖像二極管陳列檢測器）和色譜工作站，安捷倫科技有限公司；AL 104電子天平，梅特勒-托利多國際有限公司。

鹽酸度洛西汀工作用對照品（批號：20170509，含量 99.86%）；α-萘酚（雜質Ⅲ），批號為 20160628；(3s)-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(3-噻吩基)丙胺[雜質Ⅴ（3-異構體）]，批號為 RO32WO，USP 標準品；(s)-4-{甲基[3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)丙基]氨基}-4-氧代丁酸 [雜質Ⅷ（N-琥珀酰度洛西汀）]，批號為RO32XO，USP標準品；鹽酸度洛西汀腸溶膠囊，自制，批號為 T170901，T170902，T171001 及 T171002。

甲醇，色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純），永華化學科技（江蘇）有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）、磷酸（分析純）、三乙胺（分析純）、氫氧化鉀（分析純）、四氫呋喃（色譜純），國藥集團化學試劑有限公司；純化水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ZorbaxSB-C8（4.6mm×75mm，3.5 μm）或效能相當的色譜柱，辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀3.4 g與三乙胺15 mL，加1 000 mL水使其溶解，用磷酸調節pH至 5.5）-甲醇-四氫呋喃（體積比為 587∶323∶90）；流速：1.5 mL/min；紫外檢測波長：230 nm；進樣量：10 μL；柱溫：45℃；出峰順序：度洛西汀峰、雜質Ⅴ峰、雜質Ⅲ峰與雜質Ⅷ峰；理論板數：不低于2500。

1.2.2 溶液配制

（1）溶劑

取流動相1000 mL，加入60%氫氧化鉀溶液10 mL，搖勻，調節pH至10.0。

（2）供試品溶液

臨用新制。取本品內容物適量（約相當于度洛西汀100 mg），置于100 mL量瓶中，加溶劑適量，機械振搖至分散均勻，再超聲10 min使溶解，放冷；用溶劑稀釋至刻度，搖勻，離心，取上層清液濾過；精密量取續濾液5 mL，置于50 mL量瓶中，用溶劑稀釋到刻度，搖勻，作為供試品溶液。

（3）靈敏度溶液

精密量取供試品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL稀釋液置于100 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為靈敏度溶液。

（4）系統適用性溶液

取鹽酸度洛西汀對照品約11 mg、雜質Ⅴ對照品約1.0 mg、雜質Ⅲ對照品約5.0 mg、雜質Ⅷ對照品約2.5 mg，同置于100 mL量瓶中，加甲醇1 mL使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為系統適用性溶液。1.2.3 專屬性實驗

（1）樣品

稱取對照品適量 (約相當于鹽酸度洛西汀22.4 mg)，置于200 mL量瓶中，加入處方量的輔料。

酸破壞試驗：加入1 mL 2 mol/L的鹽酸溶液，放置2 h，加2 mol/L的氫氧化鈉溶液調pH至中性，作為酸破壞試驗樣品。

堿破壞試驗：加入1 mL 2 mol/L的氫氧化鈉溶液，放置5 h，加2 mol/L的鹽酸溶液調pH至中性，作為堿破壞試驗樣品。

氧化破壞試驗：加入1 mL 30%雙氧水，放置5 h，作為氧化破壞試驗樣品。

光照破壞試驗：在4 500 lx下照射22 h，作為光照破壞試驗樣品。

高溫破壞試驗：在100℃下加熱5 h，作為高溫破壞試驗樣品。

上述樣品均加溶劑適量，機械振搖至分散均勻，再超聲處理10 min使溶解，放冷，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，離心，濾過，取續濾液進樣，記錄色譜圖。

（2）空白輔料

取空白輔料適量，置于100 mL量瓶中，采用上述樣品專屬性試驗方法，對空白輔料用強光照射、高溫、酸水解、堿水解和氧化的方法進行加速破壞，處理后的樣品取續濾液進行高效液相色譜（HPLC）分析，以研究輔料是否干擾樣品有關物質的檢查。

2 結果與討論

2.1 方法學考察

2.1.1 檢測波長的選擇

取系統適用性溶液，進行DAD掃描，結果表明各雜質和鹽酸度洛西汀均在230 nm處有最大紫外吸收，故選擇230 nm為紫外檢測波長。

2.1.2 系統適用性試驗

取系統適用性溶液進樣測定，在上述色譜條件下，理論板數按度洛西汀計為6 255，度洛西汀峰與雜質Ⅴ峰、雜質Ⅲ峰及雜質Ⅷ峰之間的分離度分別為 2.32，3.36 和 11.48。

2.1.3 輔料干擾

空白輔料在主峰之前出峰，不干擾主藥的測定。

2.1.4 檢測限與定量限

精密稱取鹽酸度洛西汀、雜質Ⅲ及雜質Ⅷ對照品，分別稀釋后進樣測定，按信噪比S/N=3±1計算檢測限，按信噪比S/N=10±1計算定量限（見表1）。由表1可知，雜質Ⅲ，雜質Ⅷ及鹽酸度洛西汀的檢測限分別為 0.940，2.392，0.050 ng/mL，定量限分別為2.400，8.320，2.171 ng/mL。

表1 定量限與檢測限

2.1.5 線性關系

精密稱取鹽酸度洛西汀對照品適量，加溶劑適量使其溶解；分別精密稱取雜質Ⅲ與雜質Ⅷ對照品適量，用1 mL甲醇溶解。用溶劑稀釋成數個不同質量濃度的供試品溶液。精密吸取10 μL注入液相色譜儀中測定，結果見表2。

度洛西汀的質量濃度與峰面積在38.8～155.2 μg/mL(r=1.0000，n=8)內線性關系良好，而雜質Ⅲ和Ⅷ的質量濃度與峰面積分別在0.08～0.33 μg/mL(r=0.9999，n=8) 和 0.08～0.32 μg/mL(r=0.9997，n=8)內呈良好的線性關系。

表2 鹽酸度洛西汀及各有關物質線性關系表

2.1.6 校正因子

以表2中的線性方程計算雜質Ⅲ和Ⅷ相對于鹽酸度洛西汀的校正因子，結果顯示：雜質Ⅲ與雜質Ⅷ的校正因子均在0.2～5.0之間，但雜質Ⅲ的校正因子在0.9～1.1之外[6]（表2）。故可以采用加校正因子主成分自身對照法計算不在范圍內的雜質Ⅲ的含量，相對校正因子可確定為1.7。

2.1.7 重復性試驗

取同一批樣品的供試品溶液、對照溶液各6份進行HPLC測定，經計算雜質總量平均為0.08%，相對標準偏差（RSD）為2.9%，具有良好的重復性。

2.1.8 穩定性試驗

取同一批號供試品溶液，在 0，4，8，12，16，20，24 h時進樣測定，考察供試品中主峰峰面積的穩定性。結果表明供試品溶液在24 h內主峰沒有降解，溶液基本穩定（見表3）。

表3 穩定性試驗結果

2.1.9 回收率試驗

精密稱取鹽酸度洛西汀對照品適量，按處方量加入輔料，加溶劑溶解并稀釋至相關對照物質溶液質量濃度（20%為基準）的80%，100%，120%。精密稱取雜質Ⅲ、雜質Ⅷ對照品適量，按處方量加入輔料，加1 mL甲醇溶解，并用溶劑分別稀釋至相關對照物質溶液質量濃度（20%為基準）的40%，60%，80%，100%，120%，140%及 160%。精密量取 10 μL注入液相色譜儀中，按外標法以峰面積計算雜質Ⅲ，雜質Ⅷ及鹽酸度洛西汀的測得量和回收率，結果見表4。由表4可知，雜質Ⅲ，雜質Ⅷ與鹽酸度洛西汀的RSD分別為0.64%，1.62%和0.70%，表明3種物質的回收率良好。

表4 回收率及RSD結果匯總

2.1.10 專屬性試驗

對破壞后的樣品進行HPLC分析，結果（見表5）表明：鹽酸度洛西汀腸溶膠囊在酸、氧化破壞中有明顯降解，在堿、光照和高溫條件下表現較穩定；各破壞條件下物料守恒，產生的雜質峰能與主峰有效分離，經破壞后的空白輔料溶液均不干擾樣品中雜質的檢測。說明該色譜條件專屬性較強，可有效檢出各破壞的雜質。

表5 各強制降解試驗雜質含量 %

2.1.11 耐用性試驗

取同一批供試品溶液各 10 μL，分別于1.4，1.5，1.6 mL/min流速下進樣，測定的有關物質結果分別為0.05%，0.06%，0.06%；在流動相V（磷酸鹽緩沖液）：V（甲醇）：V（四氫呋喃）分別為 575∶335∶90，587∶323∶90 與 600∶310∶90 的條件下進樣，所測定的有關物質結果分別為0.07%，0.06%及0.06%；將色譜柱更換為DikmaInertsilC8（4.6 mm×75 mm，3 μm），測定的有關物質結果為0.05%。上述試驗結果表明該方法的系統耐用性良好。

2.2 有關物質的檢測

按自身對照法檢測并計算4批樣品中有關物質的含量，結果如表6所示。由表6可以看出，4批樣品中雜質Ⅲ和Ⅷ的含量均小于0.20%，總雜質含量均小于0.4%。

表6 4批樣品有關物質測定結果

3 結論

（1）鹽酸度洛西汀在氧化、強酸條件下容易降解；在強堿、高溫、光照條件下相對比較穩定，降解樣品的主峰峰純度符合要求，且質量守恒在90%～110%之間。

（2）雜質Ⅲ和雜質Ⅷ是鹽酸度洛西汀的主要降解產物，該降解易受酸和氧化等條件的影響。

（3）對度洛西汀有關物質的檢查方法進行方法學驗證，結果表明該方法能較好地分離雜質峰與主峰，并能夠定量雜質。該色譜條件系統適用性、精密度、專屬性、線性、溶液穩定性均良好。該方法樣品前處理簡單、分析儀器普及率高，檢測簡便、快速、準確、靈敏度高，驗證內容符合藥品質量標準分析方法驗證指導原則附錄[7]，且驗證數據準確可靠，能夠客觀地反映制劑中的雜質情況，適用于鹽酸度洛西汀腸溶膠囊的質量控制。