響應(yīng)面法優(yōu)化豬血復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑螯合工藝

黃晶晶，張福生，鄢 嫣，殷俊峰，周迎芹，謝寧寧*

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230031）

鐵是人體必需的微量元素之一，缺鐵性貧血（irondeficiency anemia，IDA）是由于體內(nèi)缺少鐵，影響血紅蛋白合成而引起的一種貧血。IDA是我國(guó)普遍存在的營(yíng)養(yǎng)缺乏性貧血，影響人口廣泛，發(fā)病率高，嚴(yán)重影響國(guó)民健康及生活質(zhì)量[1]。口服補(bǔ)鐵劑是目前世界范圍內(nèi)治療IDA較為有效的途徑之一。市售補(bǔ)鐵劑種類繁多，分為無(wú)機(jī)鐵和有機(jī)鐵2 種作用形式[2]。以蛋白質(zhì)水解所得多肽為螯合底物的復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑是針對(duì)我國(guó)IDA人群開(kāi)發(fā)的一種新型功能性產(chǎn)品，其具有含鐵量高、易消化吸收、生物利用率高等特點(diǎn)[3-5]，相對(duì)于氨基酸補(bǔ)鐵劑來(lái)說(shuō)，其價(jià)格、生產(chǎn)工藝及成本更具優(yōu)勢(shì)。早在1960年，Newey等[6]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)小肽螯合鐵可以直接被小腸吸收。多肽鐵螯合物以肽鏈中的氨基、羰基、羧基和羥基與鐵通過(guò)共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定的五元或六元環(huán)狀結(jié)構(gòu)[7]。現(xiàn)有研究大多從魚皮[8-9]、魚類副產(chǎn)物[10-11]、其他低值水產(chǎn)品[12-13]、豆類[14-16]、花生[17]和米渣[18]等可食性動(dòng)植物中獲得具有鐵螯合活性的小肽。康雯蕾等[18]制備的大米肽在最優(yōu)螯合條件下對(duì)氯化亞鐵的螯合能力為21.6 mg/g，螯合物得率為65.2%。霍健聰?shù)萚11]發(fā)現(xiàn)，舟山帶魚下腳料水解多肽亞鐵螯合物的最佳螯合條件為抗壞血酸0.1%、溫度20 ℃、時(shí)間15 min、pH 7。此外，Lee等[19]利用風(fēng)味蛋白酶從豬血漿蛋白水解物中獲得了鐵螯合活性壬肽Asp-Leu-Gly-Glu-Gln-Tyr-Phe-Lys-Gly。

豬血是生豬屠宰的副產(chǎn)品，是一種蛋白質(zhì)含量高、糖類和脂肪含量低、微量元素含量豐富的食品工業(yè)原料[20]。豬血中蛋白質(zhì)占4.3%，且為全價(jià)蛋白質(zhì)[21]。同時(shí)，豬血鐵含量為45 mg/100 g，還含有鈣、鎂、鋅、銅、磷、鉀、鈉、錳、硒等微量元素[22]。豬血離心后，血漿液占65%，其中含有球蛋白和白蛋白等；血球液占35%，其中大部分是血紅蛋白[23-24]。我國(guó)是全球豬肉消費(fèi)量最大的國(guó)家，2017年豬肉消費(fèi)總量達(dá)5 487 萬(wàn)t。我國(guó)也是全球生豬出欄量最大的國(guó)家，2017年生豬出欄量6.89 億頭[25]。因此，我國(guó)豬血資源利用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展前景廣闊。

本研究以豬血為原料，利用堿性蛋白酶制備豬血多肽，以豬血自身離子化鐵和外源鐵元素作為鐵源，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)豬血復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑螯合工藝中的pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、多肽溶液與FeCl2溶液體積比進(jìn)行研究，在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化，以期制備出吸收率高、安全、無(wú)消化道刺激、沒(méi)有副作用的多肽亞鐵螯合物復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑，為豬血蛋白資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬血，購(gòu)自合肥萬(wàn)潤(rùn)食品有限公司。

鹽酸、硝酸、高氯酸、硫酸、氫氧化鈉、氯化亞鐵、硫酸鐵銨、檸檬酸鈉、抗壞血酸、乙醇、堿性蛋白酶 合肥博美生物科技有限公司；所有溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1CE冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；1～10 mm石英微量比色皿 江蘇省無(wú)錫市晶禾光學(xué)儀器有限公司；1900PC雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海譜元儀器有限公司；KT260全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥福斯分析儀器公司；HR801酶標(biāo)分析儀 深圳市華科瑞科技有限公司；iCE 3500原子吸收光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾公司；L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑制備工藝

復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑制備工藝：豬血→離心分離→噴霧干燥→酶解→螯合→復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑

操作要點(diǎn)：向豬血中加入0.4 mg/L的檸檬酸鈉抗凝，于4 ℃、3 500 r/min條件下離心15 min，獲得血漿液和血球液，分別噴霧干燥制得血漿粉和血球粉，然后分別進(jìn)行酶解，中性蛋白酶添加量0.01 mg/L，底物質(zhì)量濃度150 g/L，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間4 h；酶解結(jié)束后于90 ℃水浴滅酶6 min，分別制得血漿酶解液和血球酶解液，隨后，將血球酶解液于3 000 r/min離心20 min，所得沉淀酸解成離子態(tài)；最后，將所得酸解液、離心上清液與血漿酶解液混合，于35 ℃、pH 6條件下螯合反應(yīng)5 h，干燥成粉，即得復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑。

1.3.2 理化與營(yíng)養(yǎng)檢測(cè)

水分含量：參照GB/T 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》[26]中的直接干燥法；蛋白質(zhì)含量：參照GB/T 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[27]中的凱氏定氮法；脂肪含量：參照GB/T 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》[28]中的索氏抽提法；鐵含量：參照GB/T 5009.90—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鐵的測(cè)定》[29]中的火焰原子吸收光譜法；氨基酸組成分析：參照GB/T 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》[30]。

1.3.3 鐵的離子化

豬血自身含有豐富的鐵元素，在螯合前需將鐵離子化，以便根據(jù)不同需求進(jìn)行添加。血漿蛋白和血球蛋白分別酶解離心，所得沉淀冷凍干燥，用稀鹽酸溶解，調(diào)節(jié)pH值至4～5，加入3%抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，制得沉淀酸解液備用。同時(shí)，酸化外源鐵溶液（1.0 mol/L FeCl2溶液中加入3%抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液）作為螯合反應(yīng)的鐵源。

1.3.4 豬血多肽溶液制備

稱取一定量的血漿蛋白粉和血球蛋白粉，分別進(jìn)行酶解，離心取上清液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的活性炭，溫度57 ℃、pH 4.3條件下脫色60 min；然后，采用中空纖維超濾設(shè)備，選取截留分子質(zhì)量為10 kD的纖維柱進(jìn)行分離及脫色，以除去大分子蛋白類物質(zhì)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至原體積的1/10，最后進(jìn)行冷凍干燥，制得多肽粉成品。使用時(shí)，用去離子水溶解多肽粉，配制成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的多肽溶液。

1.3.5 Fe2+螯合率測(cè)定

以谷胱甘肽（glutathione，GSH）（20 mg/mL）和乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（5 mg/mL）作為陽(yáng)性對(duì)照組，含有FeCl2和豬血多肽的溶液作為空白組。鐵含量采用火焰原子吸收光譜法測(cè)定[29]。Fe2+螯合率按照下式計(jì)算。

式中：c樣品、c空白和c總分別為肽-Fe2+、豬血多肽、FeCl2和豬血多肽混合溶液的鐵含量。

1.3.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、多肽溶液與FeCl2溶液（1.0 mol/L）體積比5 個(gè)因素作為主要單因素，考察各因素對(duì)多肽Fe2+螯合率的影響。

多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、多肽溶液與FeCl2溶液的體積比為2∶1時(shí)，加入固定體積的沉淀酸解液，溫度30 ℃，分別在pH值3、4、5、6、7條件下反應(yīng)1 h，測(cè)定不同pH值條件下的Fe2+螯合率。

多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、多肽溶液與FeCl2溶液的體積比為2∶1時(shí)，加入固定體積的沉淀酸解液，pH值為6，反應(yīng)時(shí)間1 h，測(cè)定在25、35、45、55、65 ℃反應(yīng)溫度下的Fe2+螯合率。

多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、多肽溶液與FeCl2溶液的體積比為2∶1時(shí)，加入固定體積的沉淀酸解液，pH值為6，反應(yīng)溫度30 ℃，測(cè)定反應(yīng)時(shí)間為15、25、35、45、55 min條件下的Fe2+螯合率。

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%、5%的多肽溶液，多肽溶液與FeCl2溶液的體積比為2∶1，加入固定體積的沉淀酸解液，pH值為6，反應(yīng)時(shí)間1 h，反應(yīng)溫度30℃，測(cè)定不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)多肽溶液的Fe2+螯合率。

多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，多肽溶液與FeCl2溶液的體積比分別選擇1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，加入固定體積的沉淀酸解液，反應(yīng)溫度30 ℃，pH值為6，反應(yīng)時(shí)間1 h，測(cè)定不同多肽溶液1.0 mol/L與FeCl2溶液體積比時(shí)的Fe2+螯合率。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇單因素試驗(yàn)中的顯著因素（pH值、多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)和多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比）進(jìn)行優(yōu)化，因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理組進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Design-Expert 8.0.5軟件，通過(guò)單因素方差分析和Duncan's多重比較分析數(shù)據(jù)顯著性并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬血粉和復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑的理化及營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)

表 2 豬血粉和復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑的理化及營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)Table 2 Chemical and nutritional compositions of pig blood powder and composite microelement iron supplement

由表2可知：豬血粉的水分含量相對(duì)較高，為10.060%，粗脂肪含量相對(duì)較低，僅0.410%；制備成復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑后水分含量下降至7.660%，粗脂肪含量上升為1.510%。此外，復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑的鐵含量達(dá)到2 280 mg/kg，相比豬血粉顯著提高（P＜0.05）。

2.2 豬血粉和復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑的氨基酸組成

表 3 豬血粉和復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑的氨基酸組成Table 3 Amino acid compositions of pig blood powder and composite microelement iron supplement%

由表3可知：豬血粉和復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑中均檢出16 種氨基酸（色氨酸在水解時(shí)被破壞，故未檢出），其中必需氨基酸7 種，氨基酸含量較為豐富。豬血粉的必需氨基酸總量為43.360%，復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑的必需氨基酸總量略低，為41.990%，其中亮氨酸含量最高，為11.900%，賴氨酸次之，為8.650%。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 pH值對(duì)Fe2+螯合率的影響

由圖1可知：pH值由3升高至5時(shí)，F(xiàn)e2+螯合率隨著pH值的升高而增加（P＜0.05），在pH值為5時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)pH值繼續(xù)升高時(shí)，F(xiàn)e2+螯合率又顯著減小（P＜0.05）。這可能是由于當(dāng)pH值大于5時(shí)，酸堿度影響了豬血多肽螯合底物的空間構(gòu)象[31]和鐵元素的形態(tài)，從而影響了鐵離子與底物的結(jié)合，故反應(yīng)時(shí)pH值應(yīng)控制在5左右。

圖1 pH值對(duì)Fe2＋螯合率的影響Fig. 1 Effect of pH value on Fe2＋ chelating rate

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)Fe2＋螯合率的影響Fig. 2 Effect of reaction temperature on Fe2＋ chelating rate

2.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)Fe2+螯合率的影響由圖2可知，反應(yīng)溫度在25～65 ℃范圍內(nèi)變化時(shí)，F(xiàn)e2+螯合率沒(méi)有顯著變化（P＞0.05），因此，反應(yīng)溫度控制在25 ℃左右即可。

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)Fe2+螯合率的影響

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)Fe2＋螯合率的影響Fig. 3 Effect of reaction time on Fe2＋ chelating rate

由圖3可知，反應(yīng)時(shí)間在15～55 min范圍內(nèi)變化時(shí)，F(xiàn)e2+螯合率沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）。因此，為提高實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)效率，反應(yīng)時(shí)間在15 min左右即可。

2.3.4 多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)Fe2+螯合率的影響

由圖4可知：多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)從1%上升至3%時(shí)，F(xiàn)e2+螯合率隨著多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增加（P＜0.05），在多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高時(shí)，F(xiàn)e2+螯合率又顯著降低（P＜0.05）。故反應(yīng)時(shí)多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)控制在3%左右。

圖4 多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)Fe2＋螯合率的影響Fig. 4 Effect of peptide concentration on Fe2＋ chelating rate

2.3.5 多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比對(duì)Fe2+螯合率的影響

圖5 多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比對(duì)Fe2＋螯合率的影響Fig. 5 Effect of volume ratio of peptide solution to FeCl2 solution(1.0 mol/L) on Fe2＋ chelating rate

由圖5可知：當(dāng)多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液的體積比低于3∶1時(shí)，F(xiàn)e2+螯合率隨著體積比的升高而增加（P＜0.05），在體積比為3∶1時(shí)達(dá)到最大值；當(dāng)體積比持續(xù)升高至5∶1時(shí)，F(xiàn)e2+螯合率反而下降（P＜0.05）。故反應(yīng)時(shí)多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液的體積比應(yīng)控制在3∶1左右。

通過(guò)以上5 個(gè)條件的豬血多肽Fe2+螯合率單因素試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，pH值、多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、多肽溶液與FeCl2溶液體積比3 個(gè)因素的變化對(duì)Fe2+螯合率具有顯著影響（P＜0.05），而反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)于多肽的Fe2+螯合率影響不顯著（P＜0.05）。霍健聰?shù)萚11]對(duì)帶魚下腳料蛋白多肽亞鐵螯合物的研究結(jié)果也證明pH值的影響顯著。在后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)中，僅針對(duì)pH值、多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比3 個(gè)因素進(jìn)行螯合工藝的優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定反應(yīng)溫度為25 ℃、反應(yīng)時(shí)間為15 min。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及其方差分析

根據(jù)Design-Expert 8.0.5軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

表 4 復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑螯合工藝的響應(yīng)面分析結(jié)果Table 4 Box-Behnken design with experimental results

采用軟件程序?qū)σ陨系膶?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，分析結(jié)果得出多肽Fe2+螯合率的回歸方程為：Y=-139.106 0+73.745 0A-1.116 5B+13.593 5C-0.865 0AB-1.380 0AC+3.415 0BC-6.146 0A2-0.636 0B2-3.056 0C2。

表 5 響應(yīng)面回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance of response surface regression model

為檢驗(yàn)上述方程的有效性，對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析。由表5可知，模型顯著（P＜0.05），說(shuō)明該模型能夠解釋大部分實(shí)驗(yàn)情況的變化，同時(shí)失擬項(xiàng)不顯著，進(jìn)一步說(shuō)明了該模型的合理性。因此，可以用此模型對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

3 個(gè)因素對(duì)補(bǔ)鐵劑Fe2+螯合率的影響比較復(fù)雜。在上述回歸方程的所有一次項(xiàng)中，對(duì)于多肽的Fe2+螯合率影響順序?yàn)锳＞C＞B，其中A項(xiàng)影響極顯著（P＜0.000 1），即pH值對(duì)螯合率的影響較大；在所有的平方項(xiàng)中，A2和C2項(xiàng)影響顯著（P＜0.05）；而交互項(xiàng)中僅BC交互項(xiàng)的影響顯著（P＜0.05）。因此，各因素對(duì)補(bǔ)鐵劑Fe2+螯合率的影響順序?yàn)閜H值＞多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比。

2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的兩因素交互作用分析

采用Design-Expert 8.0.5軟件，帶入實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分別將模型中的pH值（A）、多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比（B）及多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）的其中1 個(gè)因素固定在0水平不變，得到其余2 個(gè)因素之間的相互作用對(duì)Fe2+螯合率的影響。通過(guò)軟件的Model Graphs分別合成因素間交互作用影響的三維圖和等高線圖。

圖6 pH值和多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比對(duì)Fe2＋螯合率交互作用影響的三維圖和等高線圖Fig. 6 Three-dimensional response surface and contour plots showing the effect of interaction between pH value and volume ratio of peptide solution to (1.0 mol/L) FeCl2 solution on Fe2＋ chelating rate

由圖6可知：當(dāng)多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比為3∶1，pH值在4.0～5.0范圍內(nèi)增加時(shí)，豬血多肽的Fe2+螯合率迅速上升，pH值在5.0～6.0范圍內(nèi)增加時(shí)，豬血多肽的Fe2+螯合率緩慢下降；pH值為5.0時(shí)，豬血多肽的Fe2+螯合率隨著多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比的增加而緩慢上升。

由圖7可知：當(dāng)多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，pH值在4.0～5.0范圍內(nèi)增加時(shí)，豬血多肽的Fe2+螯合率迅速上升，pH值在5.0～6.0范圍內(nèi)增加時(shí)，豬血多肽的Fe2+螯合率緩慢下降；pH值為5.0時(shí)，豬血多肽的Fe2+螯合率隨著多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加先上升后下降。

圖7 pH值和多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)Fe2＋螯合率交互作用影響的三維圖和等高線圖Fig. 7 Three-dimensional response surface and contour plots showing the effect of interaction between pH value and peptide concentration on Fe2＋ chelating rate

圖8 多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比和多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)Fe2＋螯合率交互作用影響的三維圖和等高線圖Fig. 8 Three-dimensional response surface and contour plots showing the effect of interaction between volume ratio of peptide solution to FeCl2 solution (1.0 mol/L) and peptide concentration on Fe2＋ chelating rate

由圖8可知：當(dāng)多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液的體積比在2∶1～3∶1范圍內(nèi)增加時(shí)，豬血多肽的Fe2+螯合率緩慢上升，體積比在3∶1～4∶1范圍內(nèi)增加時(shí)，F(xiàn)e2+螯合率基本不變；多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液的體積比為3∶1時(shí)，豬血多肽的Fe2+螯合率隨著多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加先緩慢上升后下降。

2.5 最佳螯合工藝條件的確定

根據(jù)Design-Expert 8.0.5軟件程序?qū)︱瞎に嚄l件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳螯合工藝條件為pH值5.40、多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比2.16∶1、多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.27%。在此工藝條件下，補(bǔ)鐵劑Fe2+螯合率的預(yù)測(cè)值為79.37%。

在上述最佳螯合工藝條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值，獲得實(shí)測(cè)補(bǔ)鐵劑Fe2+螯合率為79.41%，較預(yù)測(cè)值高0.04%。證明響應(yīng)面分析法對(duì)于螯合工藝的優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠，有較高的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

豬血原料經(jīng)過(guò)離心、酶解、酸解及螯合等工藝，可以得到鐵含量豐富的復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑。在單因素試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，pH值、多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比3 個(gè)因素對(duì)補(bǔ)鐵劑的Fe2+螯合率具有顯著影響，而反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間則影響不顯著。選擇反應(yīng)溫度25 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 min作為固定條件，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化獲得復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑的最佳螯合工藝條件為pH值5.40、多肽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.27%、多肽溶液與1.0 mol/L FeCl2溶液體積比2.16∶1，在此條件下，補(bǔ)鐵劑Fe2+螯合率的預(yù)測(cè)值為79.37%。本研究?jī)H針對(duì)豬血加工制備復(fù)合微量元素補(bǔ)鐵劑的工藝進(jìn)行優(yōu)化，仍需要進(jìn)行產(chǎn)品效果的后續(xù)驗(yàn)證等研究。