間充質干細胞修復盆底功能障礙性疾病的進展

韓曉瑾，葉進培，平 毅

(1.山西醫科大學第二醫院，山西 太原 030001；2.山西大學生物醫院研究院，山西 太原 030006)

盆底功能障礙性疾病(pelvic floor dysfunction，PFD)發病率較高，嚴重影響著女性的生活質量，給患者帶來了巨大的心理壓力和經濟負擔，已引起全世界盆底醫學研究者的廣泛重視[1]。目前臨床上對于癥狀嚴重的PFD患者以手術治療為主，但術后仍存在較大的并發癥及長期療效的不確定，且隨著社會進入老齡化時期，PFD患者越來越多。據美國一項研究顯示，壓力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)和盆底器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)均為流行疾病，分別影響著15%～17%和3%～6%的女性[2]。因此迫切需要開發一種新的替代治療方法，為PFD患者提供更安全、更持久的治療效果。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有多向分化潛能、旁分泌功能強大的成體干細胞，近年來在組織工程與再生醫學方面得到廣泛地研究。基于MSCs的細胞治療，也是盆底醫學領域的研究熱點，是一種很有臨床應用前景的治療策略，有可能成為徹底改變POP和SUI的治療方法[3-5]。現對不同來源的MSCs在女性PFD中的研究進展進行綜述。

1間充質干細胞的概述

MSCs主要是由中胚層來源的一種成體干細胞，目前已經在骨髓、脂肪、臍帶、子宮內膜等組織中成功提取。不同來源MSCs的生物學功能特點大致相同，不僅具有多向分化潛能、自我更新和增殖的能力，還具有低免疫原性、免疫調節及歸巢至損傷組織特性，在組織損傷修復、組織再生與重建等領域廣泛應用[6-7]。自Friedenstein等[8]首次報道MSCs以來，已有多個動物實驗及臨床研究將其應用于細胞移植治療，如肝衰竭[9]、心肌梗死[10]、傷口愈合[11]、神經退行性疾病[12]等組織損傷修復及類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、炎癥性腸病等自身免疫性疾病的治療[13]。在宮腔粘連[14]、卵巢早衰[15]等婦科疾病中組織損傷修復中也有對MSCs的研究。在治療PFD方面也有很大的應用潛力。

MSCs廣泛應用于臨床疾病治療研究的主要機制有以下幾點：

①多向分化潛能：在特定的條件下定向分化為受損組織細胞促進組織修復，利用其成軟骨分化的潛能在軟骨修復及再生方面得到廣泛的研究[16]。②旁分泌及外分泌：通過分泌生物活性因子、趨化因子和細胞因子及釋放細胞外囊泡等，可改善細胞的微環境、重構細胞外基質等。近年來MSCs來源的外泌體是成為干細胞領域研究的熱點問題。Bai等[17]證實脂肪間充質干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)來源的外泌體在皮瓣移植后缺血-再灌注(I/R)損傷過程能提高皮瓣成活，促進新生血管形成，減輕I/R損傷后皮瓣的炎癥反應和細胞凋亡。③抗炎及免疫調節：可在炎性因子刺激下通過細胞間相關作用及MSCs分泌的可溶性細胞因子抑制免疫系統發揮抗炎作用。Kawata等[18]研究顯示，給結腸炎模型小鼠早期注射ADSCs后，抗細胞因子白細胞介素(interleukin，IL)-10、轉化生長因子-β(transforming growth factors-β，TGF-β) mRNA水平升高，而炎癥細胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6、IL-17α mRNA水平明顯降低。④促血管生成：MSCs不僅可分化為血管內皮細胞，也可分泌多種生長因子，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質細胞因子-1等來調節內皮細胞分化促進血管再生。基于MSCs的這一作用，其還被廣泛應用于缺血性疾病的研究中[19]，如缺血性腦卒中、糖尿病足等。⑤用于組織工程，與人工合成補片或生物材料網片上，創造出一種復合組織移植物，然后再移植回宿主體內繼續再生過程，可改善人工合成或生物網片的生物相容性，降低生物網片的降解速率。

2不同來源間充質干細胞與PFD

2.1骨髓間充質干細胞在PFD中的應用

骨髓間充質干細胞(bone-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是最早應用于盆底功能修復中的MSCs類型[20]。多個研究已證實BMSCs具有向成纖維及骨骼肌分化的潛力及促進細胞外基質重構功能。Bing等[21]將BMSCs與盆底韌帶成纖維細胞間接共培養后，分別于3天、6天、12天檢測發現BMSCs中彈性蛋白、賴氨酰氧化酶(lysyloxidase，LOX)、Fbulin-5 mRNA的表達均增加，于第12天顯著增多。Corcos等[20]和Du等[22]分別給SUI模型大鼠經尿道外括約肌區域注射大鼠BMSCs顯示，BMSCs具有向骨骼肌表型分化的潛能，修復了受損的外尿道括約肌，明顯改善了泄漏尿點壓。Zhao等[23]研究發現機械拉伸刺激盆底韌帶成纖維細胞可產生可溶性因子TGF-β及肌腱蛋白-C(tenascin-C，TNC)，激活和調節間接共培養BMSCs細胞內信號通路，促進BMSCs向成纖維細胞分化。Jin等[24]研究發現miR29a-3p是BMSCs內源性彈力蛋白表達的重要負調控因子，在BMSCs中添加miR-29a-3p抑制劑，然后將其移植到PFD大鼠體內，證實可顯著提高彈性蛋白的表達和分泌，從而促進PFD大鼠BMSCs的治療潛力。Zhao等[25]發現過氧化物酶增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR-γ)表達時BMSCs成纖維細胞的分化能力減弱，證明PPAR-γ負調節BMSCs成纖維細胞的分化。Jin等[26]通過基因修飾方式，將過表達彈性蛋白的BMSCs細胞移植到陰道擴張所致損傷成年大鼠體內，明顯改善了尿動力學試驗結果，進一步將聚乳酸乙醇酸(poly D,L-lactic/glycolic acid，PLGA)、納米顆粒(NPs)與堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)組合，移植到PFD模型大鼠體內，使bFGF持續釋放，進一步增強了過表達彈性蛋白的BMSCs向纖維分化的能力。但PFD大多數發生于中老年女性，隨著年齡的增長，自體BMSCs的數量明顯減少，增殖能力明顯減弱，且需要在麻醉下穿刺獲取，進而限制了自體移植的臨床應用。

2.2脂肪源間充質干細胞在PFD中的應用

脂肪源間充質干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)來源方便，通過簡單抽脂術獲得，患者易于接受，數量充分，是較理想的自體來源MSCs之一。ADSCs作為種子細胞，在盆底醫學中的研究方面越來越多的受到重視。Arjmand等[27]采用尿道鏡下經尿道及陰道入路注射自體ADSCs治療10例SUI患者，在注射治療后的2周、6周和24周，尿失禁明顯減少，表明將自體ADSCs注射到尿道周圍是一種安全、短期有效的治療SUI的方法。Watanabe等[28]和Cui等[29]在SUI模型大鼠尿道注射ADSCs，發現尿道周圍細胞外基質、平滑肌的含量增加，也證實ADSCs對SUI的治療有效。Liu等[30]研究表明，ADSCs通過增加膠原合成和減少膠原溶解調節SUI婦女成纖維細胞膠原代謝，并從人ADSCs中分離純化了外泌體，證明dil標記的外泌體可以轉移到SUI女性培養成纖維細胞的細胞質中，進一步證明ADSC-Exos處理成纖維細胞后，培養成纖維細胞Ⅰ型膠原水平顯著升高，還證實ADSC-Exos在SUI婦女成纖維細胞膠原代謝調控中發揮著重要的作用。以上研究均證實ADSCs可通過向成纖維細胞分化、旁分泌及外分泌功能促進膠原的表達，改善SUI癥狀。此外，ADSCs也可與生物材料結合，為盆底組織提供支撐，而且可以促進盆底組織的修復。Ochoa等[31]研究了人ADSCs接種前后對脫細胞豬真皮不同交聯率的膠原網的力學性能及細胞與支架的相互作用，發現完全交聯且接種ADSCs的膠原網彈性明顯增強，可以作為修復盆腔器官脫垂的支架。Roman等[32]也將ADSCs與可降解聚乳酸(PLA)支架構建的復合組織移植物及無細胞接種PLA支架相比，植入ADSCs的PLA支架形成的新組織中血管新生更多。

以上研究顯示脂肪是PFD治療的一種理想的MSCs來源，具有極大的臨床應用前景。但因年齡、抽取脂肪的部位和分離方法的不同，對獲得ADSCs數量有很大的影響。

2.3臍帶間充質干細胞在PFD中的應用

臍帶是妊娠期間為母體和胎兒提供營養的主要通道，是人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)獲取的來源，具有胚胎原性特性。hUC-MSCs可塑性強、無倫理學爭議、數量充足、易于分離[33]，目前已建立完善的臍血庫。多個體外及體內實驗顯示hUC-MSCs在盆底醫學領域有很大的應用潛力。楊一等(2014年)使用bFGF誘導hUC-MSCs向成纖維細胞分化，促進了細胞外基質Ⅰ型膠原的分泌。Roman等[32]將hUC-MSCs與網片結合制造組織工程筋膜，皮下移植到實驗大鼠陰道后壁內，發現新的組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量明顯增加。Ding等[34]將hUC-MSCs接種于納米纖維仿生網上，并將其植入動物模型中，未發現任何實驗動物網片發生侵蝕，且新生組織血運較未結合hUC-MSCs者大。說明hUC-MSCs同樣可以調節網片的生物學性能。因hUC-MSCs來自胎兒娩出后的臍帶組織，要實現PFD自體移植治療，需在出生時就保留臍帶組織，提取MSCs，由專門的實驗室保存。長期保存的管理費用、細胞移植的安全性等問題成為hUC-MSCs向臨床應用轉化的障礙。

2.4子宮內膜間充質干細胞在PFD中的應用

人類的子宮內膜是一個動態重建的組織，其高度的再生能力主要是由子宮內膜間充質干細胞(endometrium mesenchymal stem cells，eMSCs)介導的。eMSCs可從經血中分離，亦可通過診斷性刮宮術及子宮全切術后的標本中獲取，較骨髓穿刺或脂肪抽取操作便捷，即使絕經后女性也可在排除禁忌癥后應用雌激素刺激內膜生長以獲取自體eMSCs[35]。有文獻報道2004年首次從子宮內膜組織中分離出eMSCs[36]，并可通過流式細胞術或免疫磁珠進行分選[37]，是應用于PFD治療的一個很容易獲得的自體細胞來源，其成為具有吸引力、新的成體干細胞來源之一[38]。因eMSCs自身存在于女性盆底組織中，可能較骨髓、脂肪、臍帶來源的MSCs對于PFD的治療更具優勢，成為干細胞治療PFD的最佳種子細胞。Chen等[39]通過TGF-β對eMSCs進行誘導，證實eMSCs對陰道壁和骨盆底的平滑肌功能恢復有效。Ulrich等[40]將eMSCs與PA+G生物網片結合可使新生血管形成速度更快，血管密度更高，即使在90天內，新生血管形成的趨勢仍保持在移植物種子網狀結構的正常水平，eMSCs/PA+G網狀纖維-組織界面的巨噬細胞較單獨PA+G明顯減少。在細胞種子網格周圍沉積了更多的膠原纖維，這表明eMSCs可能促進了生理膠原的產生，從而PA+G生物網片提高了生物力學性能，減少了網片侵蝕、暴露等不良反應。Edwards等[41]將eMSCs與有凝膠涂層的尼龍網片結合共同應用于大鼠皮下組織，證明在植入之前接種eMSCs可減少異物反應，改善網狀組織復合體的生物力學性能，發現eMSCs可調節膠原生成和排列以增強網片張力。

以上研究顯示eMSCs在盆底醫學有很大的研究價值。但eMSCs受年齡、體內激素水平、提取時子宮內膜周期狀態等影響，獲得的數量有所差異。

3間充質干細胞在PFD中應用的展望

MSCs通過定向誘導向成纖維、成肌分化，分泌生物活性因子及與生物材料的結合可能是未來PFD患者治療的最佳方法之一。雖然MSCs在盆底醫學領域顯示巨大的潛力，吸引了越來越多研究者的目光，但在實現向臨床轉化之前，仍存在大量的問題，如MSCs分化能力受衰老、激素、免疫和代謝因子的影響[42]，如何保持其多向分化的潛能；怎樣實現細胞移植，局部注射還是靜脈注射；移植細胞的數量；移植后是否存在免疫排斥等，還需進一步考慮臨床應用的安全性、經濟效益。今后仍需要進行大量的動物實驗研究。