不同來源的間充質干細胞治療骨與軟骨組織疾病的研究進展

金鎮雄 唐德志* 肖延華

1．上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海200032

2．上海中醫藥大學脊柱病研究所，上海200032

3．筋骨理論與治法教育部重點實驗室，上海200032

4．井岡山大學，江西 吉安 343009

現如今，組織工程技術在骨和軟骨、血管、神經、皮膚、肌腱韌帶等組織工程領域得到迅速發展。干細胞(stem cell)是一種未充分分化、尚不成熟的細胞，具有自我復制、再生、更新、多向分化等能力的細胞。正是因為它的多分化能力和再生潛力使其大量應用于干細胞研究和再生醫學中［1］。干細胞可分為胚胎干細胞和成體干細胞兩大類，成體干細胞又可根據其特定組織來源分為造血干細胞、骨髓及脂肪間充質干細胞、臍血干細胞等。其中以骨髓及脂肪間充質干細胞在骨科應用較為廣泛。隨著年齡的增長，身體健康的下降或其他因素的影響，內在再生潛能下降時，需要在創新療法方面取得新的進展，因此基于細胞的修復策略已成為有希望的治療策略［2］。在正常情況下，它們保持靜止狀態。在通過生物信號刺激時，例如，由于組織損傷，間充質干細胞被激活并經歷對稱或不對稱分裂，并且被募集到受損部位以替換或再生受損組織。由于其強大的修復潛力，間充質干細胞已應用于不斷擴大的臨床適應證，特別是骨缺損和軟骨損失［3］。目前，以干細胞療法為基礎的骨科相關疾病治療的基礎研究報道較多。本文主要從骨髓、脂肪、骨骼肌、滑膜、胚胎源性間充質干細胞等方面介紹不同來源的間充質干細胞在骨及軟骨組織疾病的研究進展，通過總結前人卓越的治療方法，為將來的進一步研究及臨床運用奠定基礎。

1 骨髓間充質干細胞

骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有向成骨、脂肪、軟骨及神經樣等細胞的分化，并且BMSCs以其體外擴增能力強、免疫原性低和具有多向分化的潛能，因此在發現這種多能細胞群的50多年來，BMSCs仍然是最受歡迎的種子細胞。這也使得BMSCs廣泛應用于包括軟骨修復在內的骨與軟骨組織等細胞層次的臨床研究。最近在細胞標記和追蹤方面的技術進步促進了對潛在機制的研究，這使得能夠追蹤體內細胞群的譜系以研究它們的位置和功能。Park等［4］利用譜系追蹤方法，提出Mx1表達的骨髓細胞具有所有已知的BMSCs特征，它們可以遷移到損傷部位，在骨折愈合過程中提供新的成骨細胞。除巢蛋白和Mx1外，瘦素受體(LepR)是鑒定BMSCs的另一種標志物。LepR陽性細胞顯示能夠在骨髓中產生成骨細胞和脂肪細胞［5］。在骨折模型中，85%的成骨細胞在8周后顯示來自LepR陽性表達的BMSCs。應該注意的是，骨髓中的BMSCs本質上是異質的。最近，表達gremlin-1的細胞從骨髓中分離出來，這些細胞能夠成骨而不是脂肪形成［6-7］。然而，這些細胞仍然占骨折愈傷組織中28%的成骨細胞。此外，Liu等［8］通過遺傳修飾 BMSCs用于骨保護素(osteoprotegerin，OPG)遞送開發了一種新的治療策略。將OPG基因修飾的BMSCs接種在羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)支架上以促進卵巢切除術(ovariectomy，OVX)誘導的骨質疏松大鼠中的下頜骨缺損中的骨再生。證明OPG-BMSCs能夠抑制破骨細胞分化并隨后抑制破骨細胞介導的骨吸收，并且具有骨質疏松相關骨缺損重建應用的潛力。Li等［9］揭示了從去卵巢(OVX)大鼠中分離的骨髓來源的BMSCs中miR-140和miR-214的異常高表達。為了抑制miRNA水平，作者構建了表達miRNA海綿的雜合桿狀病毒載體以拮抗miR-140或miR-214，持續減弱從OVX大鼠分離的骨髓間充質干細胞miR-140/miR-214水平，促進成骨并增強在體外抑制破骨細胞成熟的能力，因此為治療骨質疏松性骨缺損找到了新的途徑。Xu等［10］將SATB2修飾的BMSCs移植在牙槽骨質疏松的OVX大鼠上，結果顯示，來自卵巢切除誘導的牙槽骨的骨髓間充質干細胞表現出典型的衰老表型，如干燥和骨生成能力減弱，衰老或破骨細胞標志物表達增加和脂肪形成能力增強。這些表型變化是SATB2介導衰老的結果。SATB2是牙槽BMSCs衰老的關鍵調節因子，其過表達降低了體外和體內這些衰老的變化。SATB2修飾的骨髓間充質干細胞移植可能是治療雌激素缺乏性骨質疏松癥引起的牙槽骨丟失的潛在策略。總之，這些研究表明骨髓間充質干細胞在骨愈合過程中發揮關鍵作用。

BMSCs具有取材容易、易于培養、能夠自我更新增殖和多向分化的潛能等優勢而廣受關注［11］。并且自體骨髓間充質干細胞移植的優點包括創傷小、無排異反應、移植后并發癥少，可有效避免傳統自體骨移植的骨缺損以及愈合延遲情況，骨髓來源穩定可靠，可反復抽取［12］。正因如此，在臨床應用上，BMSCs存在著取材難、獲得足夠的原代數量難、且間充質干細胞在骨髓中很少見，收集時易對患者帶來二次傷害等不足之處［13］。

2 脂肪間充質干細胞

脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)能夠廣泛受到關注，取決于脂肪組織在人體分布廣泛、取材方便等優點，易于收獲并存在于幾種類型的脂肪組織中，包括內臟脂肪、皮下脂肪和器官脂肪等。并且ADSCs能多向分化成為中胚層和非中胚層細胞［14］，廣泛應用于心肌梗死修復、軟骨和骨組織再生、腦組織修復、傷口愈合、皮膚組織再生、肝臟組織再生、肌肉組織修復［15］等，為許多疾病提供治療方案。Tang等［16］利用淫羊藿苷聯合脂肪干細胞對去卵巢大鼠絕經后骨質疏松模型骨質疏松癥的治療進行了研究，通過實驗證明淫羊藿苷與干細胞結合顯著降低了卵巢切除術引起的體重增加，明顯降低了堿性磷酸酶、抗酒石酸鹽酸性磷酸酶和骨骼γ-羧基谷氨酸蛋白含量，顯著增加了骨鈣蛋白的含量，并且提高腰椎和股骨的骨密度。在臨床研究上，ADSCs的第一次臨床應用是在2004年。根據美國臨床試驗報道，有121項研究注冊使用ADSCs，這些研究包括治療軟組織填充和骨組織缺損、脂肪代謝障礙、糖尿病、心血管疾病、肝硬化、移植物抗宿主病、克羅恩病、動脈硬化和肌萎縮側索硬化等［17］。

然而，如果目標是軟骨內骨折愈合，ADSCs應該謹慎使用，因為ADSCs可以產生抑制軟骨細胞增殖和刺激軟骨細胞凋亡的因子［18］，并且關于ADSCs的腫瘤增強特性的報告也要求臨床應用中使用ADSCs時應謹慎。此外，有學者報道了不同解剖部位分離的ADSCs的分化潛能以及供體性別和年齡都具有顯著差異［19］。雖然ADSCs的研究面臨種種困難，但其含量豐富，易分離獲取，過程相對簡單，是分離培養ADSCs的一個可靠來源，使得ADSCs在再生醫學中仍然是一個非常有前景的方法，相信在未來ADSCs將使更多的患者受益。

3 骨骼肌間充質干細胞

骨骼肌來源的間充質干細胞主要包括肌衛星細胞(muscle satellite cells)和肌源性干細胞(muscle derived stem cells，MDSCs)［20］。肌衛星細胞黏附在肌纖維上，位于肌膜和基底膜之間，正常情況下處于相對靜止狀態，但在骨折創傷后可顯示多能間充質干細胞活性，分化為成肌細胞(myoblast)和成骨細胞(osteoblast)，并且表達特異性的標記蛋白Pax7［21］。Pax7是肌衛星細胞重要的分子標記，在胚胎發育過程中決定衛星細胞的形成。而從受傷的骨骼肌纖維分離的骨骼肌衛星細胞在不含成骨誘導劑的條件下，仍可分化為成骨細胞［22］，表現為 ALP、Col1和Runx2及SP7/Osterix等成骨標志基因的高表達。這些結果表明，骨骼肌受到損傷之后，骨骼肌衛星細胞可以被激活向成肌細胞和成骨細胞分化。

肌源性干細胞是存在于骨骼肌并可從中分離出來的后天干細胞，具有長期增殖、高度自我更新和多向分化的特點。與其他間充質干細胞相比，MDSCs在體外培養具有良好的增殖和分化能力等優點。MDSCs也具有向成骨細胞分化的能力，但是這方面的研究卻鮮有報道。Xiang等［23］發現在含有BMP-9的培養基條件下，純化的MDSCs能向成骨細胞分化，發生礦化并形成骨組織。

骨骼肌來源間充質干細胞既能向成肌細胞分化，也能向成骨細胞分化，而對于“肌少-骨質疏松癥”這一肌肉骨骼相關的退行性疾病［24］，由于缺乏具有明確療效的治療藥物，利用骨骼肌來源的間充質干細胞移植治療可能成為一種潛在的新治療策略。

4 滑膜間充質干細胞

自首次從膝關節附近滑膜中分離出滑膜間充質干細胞(synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs)以來，其在組織工程動物模型的研究中逐日增加，可作為軟骨損傷、骨損傷及韌帶損傷等組織工程中的種子細胞。通過 Trounson等［25］與 Kondo等［26］的研究表明，SMSCs可以從正常或骨關節炎滑膜組織中獲得，其與軟骨細胞有相似的基因表達譜，這表明與其他間充質干細胞相比，SMSCs成軟骨分化能力更強。張聘等［27］研究結果表明，利用miRNA芯片檢測發現miR-202-3p表達明顯降低，抑制miR-202-3p的表達能夠顯著促進SMSCs增殖。此外，Eva等［28］在體外跨孔單層共培養中，研究SMSCs和軟骨細胞(chondrocytes，CHDR)相互作用，使用組織學、免疫染色或酶聯免疫吸附測定分析蛋白質表達，結果顯示，SMSCs與CHDR共培養時細胞聚集，隨后，細胞形成球體并失去粘附，熒光標記顯示同時出現II型膠原蛋白表達。然而，當單獨培養SMSCs時未觀察到這種現象。因此，CHDR的旁分泌作用在SMSCs中誘導軟骨形成表型，可能模仿關節穩態。這種共培養方法可以更好地理解細胞相互作用以及對軟骨修復程序的潛在影響。

SMSCs通常取自自體并且極易誘導分化，較少會發生免疫排斥反應等優點。正是如此，SMSCs已被認為是修復軟骨損傷的最為理想的種子細胞［29］。

5 圍產期組織間充質干細胞

當前針對間充質干細胞的臨床應用上，最受歡迎的是BMSCs，但是獲取骨髓是有創的，以及道德倫理問題，嚴重影響了BMSCs治療在臨床上的進展。并且成人骨髓和脂肪源性間充質干細胞需要有侵入性的采集方法，而且只能以少量的方式獲得。骨髓源性間充質干細胞的增殖能力隨供體年齡和分化能力的降低而降低［30］。除這些熱門干細胞外，胚胎干細胞具有較大的增殖和分化能力，但是涉及倫理學問題。因此，圍產期組織來源間充質干細胞受到廣泛關注，如人胎盤、臍帶、羊膜來源間充質干細胞。

5.1 胎盤間充質干細胞

在圍產期組織來源間充質干細胞中臍帶間充質干細胞成脂能力最強，胎盤間充質干細胞(human placenta mesenchymal stem cells，hP-MSCs)成骨能力最好［31］。這項研究對hP-MSCs進一步應用于骨及軟骨病的治療起到了一定的推動作用。并且hPMSCs可能通過抑制 IL-6、TNF-α、IL-1β 水平、MMPs分泌、CDH11表達及上調TGF-β水平，來減輕類風濕關節炎大鼠的關節炎癥與軟骨破壞［32］。以hPMSCs為種子細胞構建的組織工程骨可能會成為細胞療法的潛在來源。

hP-MSCs可大量獲得，具有增殖和分化能力，已逐漸成為應用前景廣闊的種子細胞。目前胎盤間充質干細胞的研究尚處于初級階段，其分離純化及鑒定尚無統一標準，仍需進一步探討。且hP-MSCs的原代培養，胰酶冷消化法具有明顯優勢，但較骨髓間充質干細胞更為困難，對無菌條件及胎盤組織的新鮮度的要求較高。

5.2 臍血間充質干細胞

人臍血間充質干細胞(umbilical cord blood mesenchymal stemcells，UCB-MSCs)具有來源含量高、免疫原性低、道德倫理爭議少等諸多優點［33］。并且通過移植UCB-MSCs在脊髓受損部位能夠促進神經元軸突的再生，對脊髓損傷性疾病及脊髓受傷后機體運動功能障礙等療效顯著，比起當前藥物治療更多只是延緩損傷進展相比，明顯提高患者今后的生存質量［34］。Lee 等［35］發現，由臍血組織誘導成的CD34+細胞可以顯著增強骨沉積及骨密度，并改善骨的顯微結構，同時可以抑制破骨細胞的分化。趙剛等［36］研究表明，相對自體BMSCs作為骨組織工程治療骨缺損存在諸多不足之處外，UCB-MSCs與BMSCs誘導組基因表達相一致，因此，表明UCBMSCs可替代BMSCs作為理想的種子細胞來治療骨相關疾病。

然而，UCB-MSCs的生存壽命有限，對生存環境要求較高，體外培養周期長、儲存難度大等方面的問題，對其在臨床治療產生阻礙，且具有一定的安全性問題，需在移植前對細胞的活力和內毒素進行檢測。雖有研究表明UCB-MSCs體內移植后的致瘤潛能很低［37］，但仍需謹慎，否則可能會出現嚴重不良后果。隨著對 UCB-MSCs研究的不斷深入，提高 UCBMSCs成軟骨分化能力，這些問題終會得到解決。

5.3 羊膜間充質干細胞

羊膜也是間充質干細胞的來源之一。羊膜間充質干細胞(amnion-derived mesenchymal stem cells，AMSCs)具有自分泌或旁分泌能力，其更新能力強，具有獨特的胎盤屏障。Topoluk等［38］研究發現，AMSCs對比骨髓及脂肪間充質干細胞產量高，可減少體外擴增數目。Topoluk還提及，AMSCs與脂肪間充質干細胞相比，可以加速成骨和成軟骨分化，具有軟骨細胞外基質再生能力。

但是目前利用AMSCs促進骨細胞分化成熟的相關研究缺乏，采用移植AMSCs治療骨質疏松很可能為骨質疏松癥的治療打開新的視野。雷鳴等［39］發現AMSCs移植對絕經后骨質疏松癥具有治療作用，可能是通過促進Runx2、Osterix表達發揮作用。并且作者利用AMSCs與蝦青素、唑來膦酸等聯合治療去卵巢骨質疏松大鼠，可以明顯提高骨密度，增加骨強度。AMSCs在修復骨及軟骨等方面所表現出的無限潛能，或在將來成為骨及軟骨疾病在臨床上的新細胞療法。

6 展望

迄今為止，間充質干細胞在骨科領域的應用發展迅速、可提升空間大，涉及干細胞修復骨、軟骨、椎間盤等多項領域，每個領域都取得了大大小小的進展。因此，間充質干細胞在骨科疾病治療中的地位越來越重要。然而，大多數的間充質干細胞治療策略仍停留在體外研究階段，在臨床應用方面還面臨著諸多問題［40］，對各種間充質干細胞的分化機理尚不明確，這使研究人員對其定向分化無法進行精確把控，且存在諸多限制骨再生的幾個因素，包括早期炎癥反應、細胞外基質組成、患者年齡、損傷類型、生理適應和血管生成能力將在很大程度上影響治療的短期和長期成功［41-42］。通常，移植物的成功依賴于能夠形成所需組織的有效種子細胞群的選擇，以及隨后的刺激提示以構建和支持這些細胞。因此，目前間充質干細胞療法中缺乏令人信服的療效仍然是與研究設計的相關問題。此外，關于體外擴增種群如何代表原始天然細胞種群的知之甚少。因此，尚不清楚體外擴增的種子細胞是完全還是僅部分代表供體人群屬性［43］。當然，身為臨床醫生也不要因為面臨諸多問題而排斥這種方法，可以將這種方法與傳統的手術治療與保守治療方式相結合，也許能取得更好的療效。另外，可結合當今熱門的3D生物打印技術為間充質干細胞提供與細胞外基質相似的環境，并且還具有可生物降解的優勢［44-45］。雖然所有研究仍處于研究階段，但鑒于該領域的研究越來越多，相信在未來基礎科學以及臨床科學的研究中，間充質干細胞移植在治療骨與軟骨組織等疾病領域有著非常好的應用前景，如骨骼肌間充質干細胞移植治療骨質疏松性骨折、滑膜間充質干細胞移植治療骨關節炎等。