分子標記技術在甘草中的應用△

李珍珍，鄭司浩，尚興樸，鄧庭偉，王繼永*，趙潤懷*

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2.中國中藥有限公司，北京 100195

甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.(也稱烏拉爾甘草)、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根及根莖，又名國老、靈通、甜草、棒草[1]。甘草性味甘平，具有清熱解毒、潤肺止咳、緩急止痛、調和藥性等作用[2]。隨著中醫學科的應用普及，國內外都對甘草的藥理作用進行了非常廣泛和深入的研究[3-10]。但不同基原甘草的有效化學成分含量有顯著的差別，且同一基原不同產地甘草的有效成分也存在差異[11-16]。

隨著分子生物技術在農作物和中藥領域的迅速發展及應用[17-20]，其對甘草的基原鑒定以及遺傳多樣性的研究層出不窮。相對于甘草傳統鑒定方法，如形態鑒別、顯微鑒別、理化鑒別、紅外鑒別、指紋圖譜鑒別等[21-24]，分子標記技術顯示出迅速準確的鑒別效果；而在甘草的遺傳多樣性上，不同的分子標記又各具特點，本文將對分子標記在甘草中的應用做出綜述。

1 分子標記技術概述

分子標記技術是研究反映生物個體、居群以及物種等分類單位間的基因組DNA片段差異的技術，廣泛應用于生物基因組探究、生物分子鑒定、生物遺傳等研究領域。分子標記的種類主要有：基于Southern雜交技術的分子標記如RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性片段長度多態性)、基于PCR的分子標記如RAPD(randomly amplified polymo-rphic DNA，隨機擴增多態性DNA)、AFLP(amplification fragment length polymorphism，擴增片段長度多態性)、SSR(simple sequence repeat，簡單重復序列)、ISSR(inter-simple sequence repeat，內部簡單序列重復)、SRAP(sequence-related amplified polymorphism，序列相關擴增多態性)、基于DNA序析的SNP(single nucleotide polymorphism、單核苷多態性)及DNA條形碼(DNA barcoding)等。

2 分子標記技術在甘草中的應用

2.1 RFLP

RFLP是20世紀70年代發展起來的分析DNA片段的技術，既能檢測基因組DNA(genome DNA)，又能夠檢測核糖體DNA(ribosome DNA，rDNA)以及葉綠體DNA(chloroplast DNA，cpDNA)，結果較穩定，而且是共顯性表達。RFLP多應用在鑒別菌落和研究菌落的多樣性[25]。谷俊等[26]采用表型數值分類、16SrDNA PCR-RFLP分析和BOX-PCR指紋圖譜分析的方法對北方地區的甘草根瘤菌進行表型、遺傳多樣性分析，結果表明，菌株表現出豐富的遺傳多樣性。

2.2 RAPD

RAPD技術不需要專門設計序列的引物，且引物的Tm值比較低，能保證寡聚核苷酸引物與模板穩定結合，允許引物和模板適當誤配，因此增大了引物在基因組DNA中配對的隨機性，提高了對DNA的分析效率。王鳴剛等[27]以不同地區的3種15組甘草(Glycyrrhizauralensis、G.infleta、G.glebra)種子為材料，研究RAPD分子標記在甘草親緣關系中應用的可行性，結果顯示，根據RAPD聚類分析方法得出15組甘草植物之間的親緣關系與形態學分類結果存在差異。吳霞等[28]應用RAPD技術探討新疆產甘草不同地理群體的遺傳多樣性，此研究證明了同一產地栽培種與野生種具有相似的遺傳特性，反應了地理環境對遺傳特性有一定的影響，為不同產地甘草的遺傳特性比較提供了理論基礎。陸嘉惠等[29]應用RAPD技術，探討甘草屬(GlycyrrhizaL.)13種1變種30個植物類群的遺傳差異和幾個爭議種的分類地位，結果顯示，基于RAPD圖譜建立的系統發育圖與經典分類學有較好的一致性，由此說明RAPD標記可為甘草屬的系統分類探究提供分子生物學依據。張增福等[30]以甘草種質為試材，采用正交試驗法設計，對影響RAPD-PCR擴增的主要因素dNTPs、引物、Taq酶和DNA模板進行優化篩選，建立了適合甘草分子研究的RAPD-PCR反應體系，為不同產地甘草種質的分子學研究提供方法依據。以上研究可見RAPD技術在甘草遺傳多樣性和分類學上起著重要的作用。

2.3 AFLP

AFLP同時具有RFLP技術與PCR技術的優點，即可靠性和高效性。周成明等[31]采用AFLP標記技術研究4個來源甘草屬植物的遺傳基礎，初步探討了AFLP在甘草品系選育中的應用，結果顯示，“民勤1號”“喀什1號”“阿克蘇1號”形成了獨特的基因構成，為烏拉爾甘草優良栽培新品種選育研究奠定基礎。葛淑俊等[32]利用AFLP分子標記對甘草主產區的16個野生種群320個單株進行遺傳多樣性研究，建立了適合野生甘草遺傳多樣性分析的穩定的AFLP體系，篩選出15對引物組合對16個種群320個單株共擴增出759條譜帶。根據各指標顯示，遺傳多樣性水平從高到低順序為寧夏、內蒙古、新疆、黑龍江、山西、甘肅酒泉，此研究得出的信息為甘草遺傳多樣性的保護和品種選育研究提供參考依據。楊全等[33]采用cDNA-AFLP(cDNA amplified fragment length polymorphism)[34]方法分析8種變異類型甘草基因表達的差異，獲得14條差異表達基因片段，并首次克隆了不同變異類型甘草特異表達的基因，篩選出了優良變異類型，為新品種選育奠定基礎，同時為甘草功能基因的研究累積參考數據。

2.4 SSR

1974年，Skinner等[35]發現了結構為-(-T-A-G-G-)n-(A-T-C-C)n的重復序列。后來研究發現，這種重復是真核基因組特有的，并稱之為“簡單重復”。在眾多分子標記中，SSR多態性豐富、數目多、分布均勻、具有共顯性以及符合孟德爾遺傳等優點，且結果穩定[36-39]。已在許多農作物的起源、遺傳圖譜建立、多態性分析、品種鑒定以及輔助育種等方面有了廣泛的應用，并且此技術穩定可靠。劉越等[40]在烏拉爾甘草中開發功能性EST-SSR分子標記，分析烏拉爾甘草EST-SSRs特征，為烏拉爾甘草EST-SSR的遺傳分布規律提供參考，也為進一步開發烏拉爾甘草功能性EST-SSR標記奠定了基礎。李曉嵐等[41]通過烏拉爾甘草表達序列標簽(EST)數據庫搜索甘草屬的SSR位點，并使用Primer3.0軟件設計引物，分析來自甘草屬4個種22份材料的EST-SSR指紋圖譜特征和聚類結果。結果表明，實驗中開發的15對引物對甘草屬具有很好的適用性，為甘草的種間親緣關系、種內遺傳多樣性研究以及物種鑒定等提供分子依據。劉亞令等[42]采用正交設計試驗建立了適合甘草SSR-PCR反應的最佳體系，利用優化體系對69對SSR引物進行了篩選，共篩選出33對在4種藥用甘草中均能有效擴增且多態性較好的SSR引物，為利用SSR標記對甘草屬植物的遺傳多樣性分析、分子輔助育種、指紋圖譜構建和物種鑒定及野生資源保護等工作提供技術支撐。

2.5 ISSR

簡單重復序列區間(inter-simple sequence repeat，ISSR)也稱錨定簡單重復序列(anchored inter-simple sequence repeat，ASSR)，是以微衛星為引物的PCR(microsatellite-primed PCR，MP-PCR)，或是在SSR基礎上發展起來的，用SSR為引物擴增重復序列之間區的DNA分析技術。ISSR采用的引物具有更強的專一性，與模板結合的強度提高，重復性好，并可揭示比RFLP、RAPD、SSR更多的多態性，此技術結合了RAPD標記技術與SSR標記技術的優點，耗資少，模板用量少，不需要知道靶標序列的SSR背景信息，使用通用引物。孫群等[43]利用ISSR分子標記技術對不同種源烏拉爾甘草的遺傳多樣性進行分析，結果表明，新疆地區烏拉爾甘草遺傳多樣性最為豐富，其次是西北地區，最低的為東北地區，并證明了基于ISSR分子標記劃分的組群與地域性沒有明顯關系。李貝寧等[44]采用ISSR分子標記技術研究來自4個產地155個甘草個體的遺傳多樣性，結果表明，各產地野生品基本都能夠各自聚為一類，內蒙古、寧夏和甘肅甘草遺傳特征較為穩定，陜西甘草的變異幅度較大，說明不同道地產區甘草的遺傳多樣性具有顯著的地域性特征，且甘草道地藥材的形成具有遺傳基礎。

2.6 DNA條形碼

DNA條形碼是利用具有足夠變異的短基因片段對物種進行準確快速鑒定生物身份的識別系統，能夠快速有效率地鑒別物種，因此得到非常廣泛的應用。劉春生[45]在研究3種藥用甘草的ITS序列中發現脹果甘草和其他甘草種類有1個堿基差異，烏拉爾甘草和其他甘草種類有3個堿基差異，并篩選出2個上游引物，成功鑒別了烏拉爾甘草和脹果甘草。陳士林[46]發表了3種藥用甘草的ITS2序列峰圖以及條形碼consensus序列及種間序列變異情況，提出將ITS2序列作為甘草的通用DNA條形碼序列。趙月梅等[47]分析了刺果甘草與甘草、苦參、黃芪基原植物編碼核糖體RNA的核基因的ITS2序列的K2P距離，且基于K2P距離構建了系統進化樹，都證明了ITS2序列可以準確鑒定這幾種藥材以及不同基原植物，為甘草等藥材及其混偽品的鑒別提供了新的研究方法。楊瑞等[48]利用PCR擴增得到了長度為616 bp的ITS序列和389 bp的psbA-trnH序列，在ITS序列中找到4個變異位點，且確定了2種ITS單倍型，在psbA-trnH序列中找到3個變異位點，并確定了4種psbA-trnH單倍型，結合ITS和psbA-trnH兩個序列的分析，確定了3種基原甘草的分子鑒定方案。

2.7 其他分子標記在甘草中的應用

分子標記技術種類很多，除了以上常見的分子技術外，也有很多用其他方法對甘草做出了研究和探討。艾鵬飛等[49]采用四因素(Taq酶、Mg2+、dNTP、引物)四水平的正交試驗設計[L16(44)]對甘草進行SRAP-PCR試驗，電泳結果采用軟件SPSS分析，退火溫度和引物篩選采用單因子試驗，優化了SRAP-PCR，反應體系為進行甘草資源遺傳分析提供了技術支持。宋鳳等[50]采用SCoT、EST-SSR分子標記對甘草屬8個自然居群的14個4種1變種個體進行基因組DNA的多態性檢測，結果表明，SCoT和EST-SSR兩種標記均可揭示甘草屬種間與種內的遺傳多樣性水平以及親緣關系，是進行甘草屬植物自然群體的遺傳結構、種間基因漸滲等研究的有效分子標記。其中，SCoT標記多態性高，信息量大，更適于甘草屬植物種質資源的遺傳多樣性分析，個體間遺傳差異檢測上EST-SSR標記效果更佳，更利于疑難種鑒定及親本分析。沈湛云等[51]采用RT-PCR技術，擴增出甘草bAS編碼區序列，運用DNAman分析軟件找出此序列的SNP位點，分析了甘草β-香樹酯醇合成酶(β-amyrin synthas e，bAS)編碼區SNP與甘草酸含量之間的相關性。臧藝玫等[52]采用PCR-SSCP和測序組合技術檢測了6個產地甘草的β-香樹脂醇合成酶(β-AS)基因的SNP，探索了甘草道地性形成的分子機制，結果證明了甘草β-AS基因94位點的SNP可能是導致甘草道地性形成的機制之一。

3 展望

由于甘草作為大宗藥材之一，應用廣泛，需求量很大，人們大量無節制采挖導致野生甘草資源遭到嚴重破壞，人工甘草將成為野生甘草的重要替代資源，導致各地方甘草的種植非常混雜，種源信息不明，影響著甘草的質量評價[53]。近年來，分子標記技術對甘草的道地性研究、品種鑒定、遺傳多態性分析等方面的研究層出不窮，為甘草基因上的研究做出了很大的貢獻[54]。但在利用此技術研究甘草時會有兩個問題，一是分子技術的重現性和穩定性；二是實驗樣品的理想性，即甘草樣品收集時會出現種源信息不準確，這些問題嚴重影響著實驗分析結果和結論。為了得到全面準確的結果，已有研究者通過多種方法同時對同一種中藥材進行研究[55-56]。目前，對甘草的分子標記的引物設計及其反應條件都在不斷地改善[33，53]，不管是研究樣品資源的收集還是技術的改進都具有進一步的發展價值。