植物分子抗病機制研究進展

蘇燕妮

（桓仁縣農業發展服務中心，遼寧 桓仁 117220）

自19世紀40年代末基因對基因假說的誕生就標志著分子生物學手段在植物抗病性研究中奠定了基礎。植物抗病基因反映了植物對特體病原體的識別以及植物能否啟動防衛反應的能力，抗病基因編碼的產物決定了植物是否能識別特異性的病原菌，同時也在對植物防衛反應基因表達有著直接或間接的影響。植物中存在著抗侵染、抗擴展、預成抗性、誘導抗性、結構抗性、生化抗性、過敏性壞死反應和系統獲得性抗性等。在1992年第一個抗病基因（Hml）被分離后，陸續有很多抗病基因被分離。

1 植物抗病基因類型

大多數植物抗病基因可根據其保守結構的不同分為五大類。通過對已經克隆的抗病基因的氨基酸序列比對發現抗病基因之間具有一些共同的結構域，即：核苷酸結合位點（NBS，nucleotide）、富亮氨酸重復（LRR，leucinerichrepeat）、跨膜結構域（T M，transmembranedomain）、絲氨酸-蘇氨酸激酶結構（STK， serine/threonine kinases）、亮氨酸拉鏈（LZ，leucine）、Toll-白介素-1區域等（TIR，tollinterleukin-1 region）。

2 植物抗病基因研究方法

近年來，隨著分子生物學的快速發展并且與基因組學的結合使得基因克隆技術不斷創新，不斷進步，很多種基因克隆方法也在此過程中產生。

2.1 轉座子標簽技術（Transponson tagging）

轉座子標簽技術利用轉座子這樣的一段可以從一個基因座位移動到其它基因座位的特異DNA片段作為探針獲得完整基因的技術方法。它很早就已發展成為一個高效率研究功能基因的主要工具之一，此項技術在后來的研究中又陸續得到了很多植物的抗病基因，比如番茄抗葉霉病基因Cf-9、Cf-4、Cf-5；煙草花葉病毒基因N；番茄抗花葉病毒基因Tm-2；亞麻的抗葉銹病基因L6等。

2.2 染色體移步法（Chromosome Walking）

染色體步移技術是一種可以得到與已知基因序列相鄰的未知基因序列的方法。根據已公布的基因或已知的分子標記連續步移，獲得重要調控基因，例如啟動子的克隆及其功能的研究；應用該方法獵取目標植物中某段基因的非保守區域，就能得到一條相對完整的目的基因序列。此項技術適用于大多數基因組序列尚未知曉的生物，如果想得到某個區域兩端的DNA序列，染色體步移法是個高效的途徑。

2.3 圖位克隆法（Map-based cloning）

根據目標基因序列在相應染色體上的位置進行克隆的方法，又稱定位克隆法（positional cloning）。經常在基因表達產物未知和沒有適宜的相對表型的產物功能信息的情況下應用，該項技術經常與分子標記等相關技術配套使用，隨著其他幾項技術的日趨成熟，圖位克隆法的應用范圍越來越廣泛。通過與序列數據庫以及分子標記方法的結合，人們已經克隆得到了很多抗病基因，以小基因組的模式植物為主，比如番茄抗霜霉病基因Pto。這種方法同樣也存在著一定的局限性，在實際中因其構建的克隆群難度較大，提供不了基因功能的相關信息以及精細作圖成本太高等問題都限制了該技術的應用范圍。

2.4 m RNA差異顯示技術（mRNA differetial display）

克隆差異性表達基因的高效率且方便的途徑。目前已廣泛應用于對比植物差異表達基因和尋找抗病基因中。mRNA差異顯示技術具有高效、靈敏度高、操作簡單、周期短、可逐步驗證等優點，應用該技術可同時比較多個樣品基因表達間的差異，對RNA量的要求也不高，操作周期一般在8天左右。隨著該項技術的不斷改進，mRNA差異顯示技術可以在克隆差異基因的基礎上用來尋找抗病基因。

2.5 同源序列克隆法

關于抗病基因的研究一直以來都是人們研究的熱點，伴著現代分子生物學等相關技術的不斷發展和進步，人們應用圖位克隆法（Map-based cloning）和轉座子標簽法（Transposon tagging）克隆出許多有意義的植物抗病基因，這對植物生產以和各個學科的發展具有深遠的意義。但是這兩種方法都有一定的局限性，只能克隆基因組較小，遺傳圖譜和物理圖譜有高的分辨率的植物基因，而不適用于基因組大，重復序列多，分子標記圖譜比較難構建的植物中。而同源序列克隆法是根據抗病基因的表達的蛋白功能保守區設計合適的引物，并擴增目標基因組DNA或者cDNA，從而從植物體中得到一個或幾個結構上與抗病基因相關的片段。在R基因庫中篩選得到的片段，比對序列的同源性，分析得到的序列與已知R基因是否有聯系，進一步得到抗病基因相關序列的目的。該方法的理論依據是雖然抗病基因識別的病原種類有區別，但是抗病基因編碼的蛋白質具有同源序列，因此，根據這些同源序列設計引物尋找抗病目的基因是可行的。當然還有很多通過生物信息學方法和高通量測序的方法來尋找植物抗病相關基因，這些方法都會在人們對抗病基因探索的過程中起到至關重要的作用。