流式細胞術在食品微生物檢測領域的研究進展

□ 夏天爽 盤錦檢驗檢測中心

前言

流式細胞術是集現代物理電子技術、激光技術和計算機技術于一體的先進細胞分析技術，具有檢測速度快、檢測指標多、采集數據質量高、分析全面、分選純度高和分選靈活等特點[1]。目前，流式細胞術已廣泛應用在臨床醫學、食品安全、海洋生物基礎科學研究等眾多行業，特別是在食品微生物檢測領域，流式細胞術已成為重要的檢測手段之一，且呈現出良好的應用前景和發展趨勢。因此，本文就流式細胞術在食品微生物檢測領域的研究進展進行了綜述。

1 微生物在食品中的危害

當前，食品中的微生物可分為3類—可用于生產的微生物、引起食品變質腐壞的微生物和食源性病原微生物[2]。其中，引起食品變質腐壞的微生物和食源性病原微生物是導致食品安全問題的主要原因，且此類微生物能夠對人類機體造成直接的毒性作用—產生過敏反應或導致腸道腹瀉，嚴重威脅人體健康。如2011年發生于德國的“毒黃瓜”事件，因其迅速席卷歐洲和美國，一度讓人們陷入恐慌，而此次疫情是由出血性大腸桿菌污染所引起，最終造成了12個國家近3000人感染，30多人死亡[3]。因此，加強食品中微生物的檢測不僅有助于防止微生物指標不合格的食品流入市場，還能保障食品的安全，滿足人們對綠色食品的需求。

2 流式細胞儀的基本結構與工作原理

流式細胞儀的基本結構主要由4部分組成，即流動室與液流系統、光源與光學系統、信號收集與信號轉換系統、計算機與分析系統，其工作原理主要分為分選功能和分析功能。

2.1 流式細胞儀分選功能的工作原理

目前，流式細胞儀的分選功能主要由分選器根據所測定參數來完成。雖然其分選方式分為通道式分選和電荷式分選，但這兩種分選方式都通過分離含有單細胞的液滴而實現。其中，流式細胞儀分選功能的過程為：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據所測定的參數由邏輯電路判定是否將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴進行充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場時發生偏轉，進入收集管路；未被收集的液體以廢液的形式被處理[4，5]。

2.2 流式細胞儀分析功能的工作原理

當前，流式細胞儀分析功能的實現主要是通過3種信號來完成，即前向散射光、側向散射光和熒光信號。前向散射光的大小與細胞直徑成正相關，即細胞直徑越大，前向散射光越大；細胞直徑越小，前向反射光越小。側向散射光的強度與細胞內顆粒結構的質量成正相關—細胞內顆粒結構越復雜，質量越大，側向散射光越大；細胞內顆粒結構越簡單，質量越小，側向散射光越小。而熒光信號的強度則與細胞膜表面抗原強度或細胞內物質的濃度有關[5，6]。

3 流式細胞術在食品微生物檢測中的應用

就目前而言，流式細胞術在食品微生物檢驗中的應用主要可歸納為4個方面，即細菌計數、微生物活性的檢測、食物中致病菌的檢測、益生菌方面的應用。

3.1 細菌計數

食品中的細菌數量是判定食品受微生物污染程度的重要標志。目前，常規的細菌計數方法主要為活菌測定法和直接計數法。其中，活菌測定法主要包括平板計數、涂抹法、濾膜法和MPN法；直接計數法主要包括自動菌數測定儀和計數板計數法。但是，以上常規計數方法都存在一定的局限性，例如，細菌培養受特定培養基和培養條件限制，死菌和受傷菌不能在檢測培養基上形成菌落，進而導致無法計數。與常規的細菌計數方法相比較，流式細胞術在進行細菌計數時，不僅無需使用培養基對細菌進行培養，還能對受傷菌和死菌進行檢測。Van Nevel S等[7]利用流式細胞術對飲用水中的微生物進行常規評估，發現流式細胞術可快速準確地對飲用水中的細菌豐度進行量化。孫芝楊等[8]研究發現，流式細胞術能消除乳制品中蛋白質、體細胞和脂肪的干擾，并可快速準確地檢測乳制品中的細菌總數。綜上所述，流式細胞術為食品微生物檢測中的細菌計數提供了新的思路。

3.2 微生物活性的檢測

在食品的生產過程中，對可用于食品生產的微生物、引起食品變質腐壞的微生物和食源性病原微生物的活性進行檢測，不僅能有效評價益生菌等產品的質量，還可有效評價食品的滅菌效果。姜凱[9]通過研究發現，流式細胞術能夠檢測發酵乳制品中乳酸菌的活菌數量，進而評價發酵乳制品中的乳酸菌含量。張波等[10]通過研究發現，流式細胞術可用于啤酒酵母生長的檢測，且該方法快捷、可靠。綜上所述，流式細胞術可廣泛應用于微生物活性檢測當中。

3.3 食品中致病菌的檢測

食品在原料、生產、儲藏、運輸和銷售等各個環節常常與土壤、水、操作人員、加工設備和包裝材料等發生不同方式的接觸，進而容易引起微生物污染，并導致食源性疾病的爆發。目前，隨著人們對綠色食品要求的不斷提高，衛生監管力度的不斷加強，食品中微生物的檢測方法也在不斷完善。流式細胞術作為生命科學領域研究的先進技術，已成功應用到食品中大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、霉菌和單增李斯特菌等致病菌的檢測之中。Williams A J等[11]基于流式細胞術建立了一種檢測菠菜中大腸桿菌O157:H7的新方法，經研究發現，新建立的方法優于傳統的細菌分析方法。黃韻[12]采用流式細胞術對冷鮮肉中的單增李斯特菌進行檢測，并與平板計數法、PMA-qPCR技術進行比對，經研究發現，流式細胞術優于平板計數法和PMA-qPCR技術。流式細胞術之所以能夠快速準確地檢測食品中的致病菌，主要是因為致病菌經過熒光染料處理后，在特定波長激發光的激發下會產生熒光，并被流式細胞儀的信號收集與轉換系統收集，進而特異性的檢測致病菌。

3.4 益生菌方面的應用

益生菌作為一類能夠定植于人體腸道和生殖系統內的有益微生物，不僅能夠促進人體腸道微生態的平衡，還可提高人體對細菌病毒感染的抵抗能力。鄭亦舟等[13]研究發現，流式細胞術可快速地對市場上含有保加利亞乳桿菌飲料中的活性菌進行有效的實時監測。杜耿記等[14]應用流式細胞術建立了一種酸奶中乳酸菌含量的快速檢測方法，發現該方法可大幅度縮短培養時間，且準確率較高。綜上所述，流式細胞術不僅可對含有微生物的食品進行有效的監測和放行，還有助于食品企業對產品進行自查、自檢。

4 結語

流式細胞術可直接對部分食品中的微生物進行檢測，這不僅能夠極大縮短檢測時間，且獲得檢測結果的準確率較高。此外，隨著流式細胞儀產品的不斷更新，流式細胞術對細胞的計數和識別等已實現多參數、多色熒光分析，且應用范圍愈發廣泛。但流式細胞術在食品微生物檢測過程中也存在一定的局限性和欠缺，如食品中含有不同的基質，且成分復雜，而流式細胞儀只能對細胞或生物顆粒乃至具有可溶性的生物分子進行直接的檢測和分析；食品中含有的不同基質需要不同的熒光染料進行標記，但標記后的不同基質存在熒光信號重疊現象，而重疊區域越大熒光信號檢測的準確性越低；部分待檢查的食品細胞或生物顆粒自身大都攜帶基礎熒光，而這些基礎熒光的存在可能對檢查結果造成干擾；流式細胞術在檢測食品微生物時，其中的熒光染料能夠使食品中的基質出現特異性熒光，而熒光染料具有一定的局限性，不能滿足食品中復雜基質的檢測等。