miRNA在腎臟缺血再灌注損傷中的作用研究進(jìn)展

潘旭鳴 陳丹壘 馬紅珍

缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是指組織或器官在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后損傷反而加重，甚至出現(xiàn)損傷不可逆的現(xiàn)象。組織或器官缺血后缺氧，從而產(chǎn)生損害，但再灌注后卻可能因為活性氧在組織或器官中的再度富集而造成二次損傷。研究發(fā)現(xiàn)，腎臟IRI是導(dǎo)致急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的主要原因之一[1]。缺血所致的低氧過程，與再灌注誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)激活共同成為腎組織損傷的原因，而IRI不可避免的存在于腎臟移植、心臟外科手術(shù)等過程中。盡管臨床對腎臟IRI的研究頗多，但其確切機(jī)制尚未闡明，亦未發(fā)現(xiàn)良好的防治方法。

miRNA最早于1993年由Ambros研究小組在秀麗線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)[2]，其后miRNA被證實(shí)在各類物種中均具有高度的保守性。miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起關(guān)鍵作用，并且參與了幾乎所有細(xì)胞的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡等[3]，可與靶基因mRNA 3'端非編碼區(qū)完全或不完全結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白質(zhì)合成[4]。迄今為止，人類基因組已發(fā)現(xiàn)超2 000個miRNA。在生物體內(nèi)，miRNA的特異性不強(qiáng)，一個miRNA可以作用于多個靶基因，包括轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、受體等，占人類基因1%的miRNA可能調(diào)控30%以上其他基因的表達(dá)，多個miRNA也可以共同調(diào)控一個靶基因的表達(dá)，因此，miRNA與靶基因之間組成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[4]。近年來，miRNA也被發(fā)現(xiàn)在疾病的診斷與治療中扮演關(guān)鍵的角色。本文就miRNA在腎臟IRI中的作用研究進(jìn)展綜述如下。

1 腎臟IRI發(fā)生機(jī)制

腎臟IRI是造成患者發(fā)生AKI的主要原因，膿毒血癥、休克、腎動脈狹窄、冠狀動脈搭橋術(shù)或腎移植術(shù)等都可以通過腎臟IRI誘發(fā)AKI，其致死率與致殘率較高。從病理上看，腎臟IRI以腎小管間質(zhì)病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)，尤其以近曲小管損傷多見，并伴有小管上皮細(xì)胞的凋亡壞死與修復(fù)過程[5]。腎臟IRI可導(dǎo)致腎小管間質(zhì)炎癥、細(xì)胞凋亡與壞死、細(xì)胞修復(fù)能力減弱等，也可以通過激活免疫應(yīng)答反應(yīng)導(dǎo)致組織損傷[6-7]，其中炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬在損傷發(fā)生過程中有著不可替代的作用。

1.1 炎癥反應(yīng)介導(dǎo)腎臟IRI 炎癥反應(yīng)在腎臟IRI過程中與各種類型細(xì)胞均有關(guān)，并且在病理生理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。腎臟IRI會啟動腎臟組織及細(xì)胞內(nèi)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，并導(dǎo)致?lián)p傷，因此抑制炎癥反應(yīng)是保護(hù)腎臟組織免受IRI的重要思路之一[8]。趨化因子是炎癥反應(yīng)中重要的中介分子之一，在炎癥反應(yīng)中起到調(diào)節(jié)并活化促炎因子，增強(qiáng)黏附分子表達(dá)的作用[9]。促炎因子如IL-6、TNF-α等在腎臟IRI致腎功能障礙過程中起到關(guān)鍵作用。研究顯示，抑制IL-6及TNF-α表達(dá)后，可以在細(xì)胞水平減輕IRI導(dǎo)致的腎臟損傷[10-11]。同時，炎癥介質(zhì)、活性氧簇以及細(xì)胞黏附分子如細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1（ICM-1）、P-選擇素等，可以通過募集白細(xì)胞與中性粒細(xì)胞至發(fā)生缺血的組織處，增強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞腫脹并進(jìn)一步阻礙血液的運(yùn)行[12-13]，加重腎臟損傷。

1.2 氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)腎臟IRI 在腎臟IRI過程中，損傷的組織可以產(chǎn)生大量的活性氧簇，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，線粒體發(fā)生氧化磷酸化障礙，ATP生成減少，激活磷脂酶，造成生物膜損傷，細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流而導(dǎo)致鈣超載[14]。當(dāng)血液再灌注后，產(chǎn)生大量的氧自由基，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生自由基介導(dǎo)的組織損傷[15]。自由基形成所導(dǎo)致的組織損傷借助膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)與蛋白質(zhì)、DNA的氧化損傷可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡的過程[16]。因此，抑制自由基及其相關(guān)產(chǎn)物可以有效保護(hù)IRI的腎組織，減少損傷。

1.3 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬介導(dǎo)腎臟IRI 腎小管上皮細(xì)胞因急性缺血而出現(xiàn)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬反應(yīng)是低血容量、低血壓、心力衰竭等的共同病理環(huán)節(jié)[17]。腎小管上皮細(xì)胞壞死會引起水、電解質(zhì)、大分子物質(zhì)在細(xì)胞間擴(kuò)散失控，造成腎小管濾過時產(chǎn)生回漏，使腎小球濾過率降低。研究發(fā)現(xiàn)，眾多分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腎小管上皮細(xì)胞壞死、凋亡及自噬相關(guān)。如p53-sestrin2信號通路及HIF-1α-BCL2信號通路等，均可在缺血的刺激下啟動并激活，進(jìn)一步改變腎小管上皮細(xì)胞的自噬及凋亡水平，具有潛在的保護(hù)作用[18]。低氧可以誘導(dǎo)mTOR及unc-51樣自噬激活激酶1（ULK1）解離，誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生[19-20]。細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，ULK1與AMPK、c-jun、beclin-1等信號分子存在交互作用，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬過程[19-22]。

2 miRNA在腎臟IRI診斷中的應(yīng)用

近年來，尋找新型的生物標(biāo)志物成為腎臟IRI研究的主要熱點(diǎn)之一。miRNA的表達(dá)不僅可以逆轉(zhuǎn)腎臟IRI，保護(hù)腎臟功能，更可以作為腎臟IRI診斷與鑒別診斷的生物標(biāo)志物。腎臟IRI過程中miRNA的動態(tài)變化、其組織特異性表達(dá)模式與分析方法，甚至其在尿液和血液中的不同分布，均使得miRNA成為腎臟疾病生物標(biāo)志物的理想候選者[23-24]。有學(xué)者對大鼠發(fā)生腎臟IRI后不同時間點(diǎn)的血清及腎組織miR-192進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)血清miR-192水平提高4倍但腎組織miR-192水平下降40%；該研究團(tuán)隊又選取93例心臟手術(shù)后患者血清進(jìn)行驗證后發(fā)現(xiàn)，心臟手術(shù)術(shù)后發(fā)生AKI的患者血清miR-192水平在進(jìn)入ICU的同時開始升高，并在2h內(nèi)維持穩(wěn)定，24h后開始下降[25]，提示血清miR-192可以成為預(yù)測心臟手術(shù)后發(fā)生腎臟IRI的生物標(biāo)志物之一。亦有研究指出，在小鼠IRI中，尿液miR-10a、miR-30d濃度與發(fā)生IRI后小鼠尿液中KIM-1及NGAL濃度呈正相關(guān)，反映了尿miR-10a與miR-30d濃度與小鼠IRI嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[26]。在一項22例腎臟IRI患者的研究中發(fā)現(xiàn)，腎臟IRI患者尿miR-21水平是正常對照組的1.5倍，而尿miR-155水平則相較正常對照組顯著降低，提示尿miR-21與miR-155均可以有效鑒別患者是否發(fā)生腎臟IRI，并具有一定的診斷效能[27]。

3 miRNA在腎臟IRI發(fā)生機(jī)制中的作用

部分miRNA被臨床驗證可作為腎臟IRI所致AKI的診斷生物標(biāo)志物外，亦有大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以作為信號分子參與腎臟IRI發(fā)生機(jī)制與病理生理過程，反映了其作為潛在的治療靶點(diǎn)的生物學(xué)功能。

3.1 調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng) 腎臟IRI過程中，由于細(xì)胞、組織缺血缺氧導(dǎo)致自由基、活性氧簇等大量激活，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn)，部分miRNA可以阻斷這一過程，減輕缺血及再灌注階段對腎臟的損傷，降低腎功能受損程度。Muratsu-Ikeda等[28]采用低氧誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞模型，模擬腎臟缺血缺氧環(huán)境后發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)miR-205水平明顯下調(diào)，敲除細(xì)胞內(nèi)miR-205基因后，HK-2細(xì)胞表現(xiàn)出對低氧環(huán)境更高的敏感性，對氧化應(yīng)激的敏感性也相對升高，相對未敲除組細(xì)胞損傷程度更嚴(yán)重，細(xì)胞活力更差，補(bǔ)充miR-205后細(xì)胞活力有所恢復(fù)。進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)，miR-205可以與細(xì)胞內(nèi)脯氨酸羥化酶1（PHD1）結(jié)合，從而降低HK-2細(xì)胞對低氧環(huán)境及氧化應(yīng)激反應(yīng)的敏感性，最終提高細(xì)胞對低氧環(huán)境的耐受性。另有動物實(shí)驗證實(shí)，在大鼠腎臟 IRI 后，miR-29a[29]、miR-34a[29]、miR-423-5p[30]、miR-320[31]在腎臟組織內(nèi)的表達(dá)水平與腎臟組織氧化應(yīng)激水平同步上調(diào)，在使用間充質(zhì)干細(xì)胞治療后腎臟組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平及miR-29a、miR-34a均有所下降[29]；抑制大鼠腎臟組織miR-423-5p表達(dá)后，大鼠腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕，腎臟損傷較未抑制的大鼠明顯減小，miR-423-5p可能通過抑制谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶M1（GSTM1）誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，減弱組織細(xì)胞損傷修復(fù)，從而造成組織損傷[30]；而miR-320水平上調(diào)所致的腎臟組織氧化應(yīng)激反應(yīng)與腎臟損傷表現(xiàn)均可以被卡托普利逆轉(zhuǎn)[31]。

3.2 參與炎癥反應(yīng) 腎臟IRI過程中，在缺血缺氧階段，炎癥反應(yīng)開始迅速啟動，并產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)而造成腎臟損傷。動物實(shí)驗與細(xì)胞實(shí)驗證實(shí)，腎臟IRI后，miR-21水平顯著升高，通過抑制PTEN蛋白水平[32]，激活PI3K/AKT通路，從而抑制腎臟IRI過程中炎癥因子的產(chǎn)生，減輕腎臟損傷[33]。同時，miR-21可以抑制絲裂原活化蛋白激酶3（MKK3）從而降低腎組織IL-6、TNF-α水平，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)腎臟，減輕IRI[34]。Lan等[35]在小鼠腎臟IRI過程中發(fā)現(xiàn)，小鼠腎臟組織miR-494水平在IRI后1h開始升高，進(jìn)一步研究證實(shí)，miR-494可以直接抑制轉(zhuǎn)錄因子ATF3，誘導(dǎo)炎癥因子及黏附分子如 IL-6、P-選擇素、單核細(xì)胞趨化因子-1（MCP-1）大量表達(dá)，加劇IRI后腎臟損傷。在利用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療腎臟血管性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-26a可以抑制腎血管內(nèi)TNF-α表達(dá)，升高IL-10水平，產(chǎn)生一定的抗炎作用[36]。而慢病毒轉(zhuǎn)染miR-26a基因的小鼠在腎臟IRI后可以抑制IL-6表達(dá)并刺激調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成，減輕腎臟炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腎臟IRI后功能的恢復(fù)[37]。對miR-146a敲除小鼠進(jìn)行腎臟IRI過程模擬后發(fā)現(xiàn)，miR-146a可以通過調(diào)節(jié)IL-1受體相關(guān)酶1，從而影響CXCL8/CXCL1信號通路，相較于野生型小鼠，miR-146a基因敲除小鼠在腎臟IRI后，表現(xiàn)出更輕的腎小管損傷，更低的NF-κB等炎癥因子水平[38]。

3.3 調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬水平 在腎臟IRI過程中，缺血缺氧及再灌注后導(dǎo)致的自由基損傷、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)最終均可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞自噬及凋亡反應(yīng)產(chǎn)生，產(chǎn)生腎臟損傷。在低氧誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，miR-21可以抑制細(xì)胞自噬。小鼠腎臟IRI模型中發(fā)現(xiàn)，miR-21基因敲除后，小鼠腎臟程序性細(xì)胞凋亡蛋白4（PCDP4）明顯上調(diào)，加速細(xì)胞凋亡，加重腎臟IRI[39]。Cui等[40]對IRI小鼠腎臟組織進(jìn)行miRNA芯片分析后發(fā)現(xiàn)，小鼠腎臟在IRI后miR-18a、miR-210表達(dá)明顯異常，PTEN基因是miR-18a的目標(biāo)基因，與p53凋亡信號通路有關(guān)，miR-210的靶基因為bcl2，同樣可以調(diào)控細(xì)胞凋亡程度，影響腎臟IRI發(fā)生、發(fā)展。在腎臟IRI過程中，miR-687可以抑制PTEN蛋白，促進(jìn)細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡[41]。Hao等[42]發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟IRI后體內(nèi)miR-17-5p水平明顯升高。進(jìn)行低氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，缺氧后細(xì)胞內(nèi)miR-17-5p水平升高，依賴p53蛋白作用，直接抑制死亡受體6（DR6），減輕低氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，提示p53/miR-17-5p/DR6通路可能是小鼠IRI的重要發(fā)生機(jī)制之一。另有小鼠腎臟IRI實(shí)驗證實(shí)，miR-34a在小鼠IRI后表達(dá)上調(diào)，可以通過結(jié)合Atg4B基因的3′非編碼區(qū)，直接抑制腎小管上皮細(xì)胞的自噬活性，從而加重腎臟IRI[43]。Lorenzen等[44]發(fā)現(xiàn)，腎移植后發(fā)生急性排異反應(yīng)的患者血miR-24水平明顯上調(diào)，后在離體細(xì)胞模型中證實(shí)，低氧誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞后可以觀察到miR-24在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)特異性富集，并直接參與細(xì)胞凋亡過程，故推測抑制miR-24可能成為治療腎臟IR的靶點(diǎn)之一。

4 miRNA介導(dǎo)腎臟IRI恢復(fù)

在腎臟IRI動物模型研究中發(fā)現(xiàn)，部分miRNA具有促進(jìn)腎臟IRI恢復(fù)的作用。Zheng等[45]建立大鼠腎臟IRI模型后發(fā)現(xiàn)，miR-381在腎小管上皮細(xì)胞中可特異性結(jié)合CXCR4基因，抑制CXCR4基因及其相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)如SDF1、VEGF、HIF-1α等，從而增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞增殖，減輕上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)大鼠腎臟IRI恢復(fù)。Song等[46]建立了特異性敲除小管上皮細(xì)胞miR-17-92小鼠模型，并對其造成腎臟IRI，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除miR-17-92的小鼠腎臟缺血再灌注后損傷程度較正常小鼠更為強(qiáng)烈，在外源性補(bǔ)充miR-17-92后可以部分逆轉(zhuǎn)缺血再灌注造成的腎臟損傷，提示miR-17-92具有潛在治療腎臟IRI的作用。

5 miRNA與低氧誘導(dǎo)因子（HIF）在腎臟IRI中的作用

HIF活化在IRI缺血或者低氧階段起重要的作用[47]。HIF的轉(zhuǎn)錄活性受HIF-α特定殘基的翻譯后羥化作用調(diào)節(jié)。HIF的靶點(diǎn)包括負(fù)責(zé)血管舒縮調(diào)節(jié)基因（如腎上腺髓質(zhì)素、eNOS、血紅素加氧酶）、能量代謝（如GLUT-1、碳酸酐酶-9）、血管生成的信號（如血管內(nèi)皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子受體-1）和細(xì)胞保護(hù)作用（如腎上腺髓質(zhì)素、促紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子、HSP70）。因此，適當(dāng)激活HIF可以改善缺血細(xì)胞存活狀態(tài)，并促進(jìn)有益的適應(yīng)性變化。抑制HIF-1α羥化酶從而穩(wěn)定甚至激活HIF已成為許多疾病如心肌缺血、缺血性腦卒中和急、慢性腎損傷的治療策略與研究熱點(diǎn)之一[48-49]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可受HIF-1α調(diào)控從而影響腎臟IRI過程。Aguado-Fraile等[50]發(fā)現(xiàn)，在大鼠腎臟IRI模型中，大鼠miR-127明顯上調(diào)，進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗顯示，miR-127上游受HIF-1α調(diào)控，下游調(diào)控驅(qū)動蛋白家族3B（KIF3B），參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞內(nèi)骨架穩(wěn)定及細(xì)胞內(nèi)信號分子傳導(dǎo)等生理活動。Wang等[51]通過低氧誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞模擬腎臟IRI過程發(fā)現(xiàn)，低氧損傷后HK-2細(xì)胞內(nèi)miR-20a-5p水平顯著減少，并發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p受HIF-1α調(diào)控，并可以與自噬相關(guān)16樣蛋白1（ATG16L1）的mRNA的3′端相結(jié)合，從而影響腎臟IRI過程中細(xì)胞自噬水平。Wei等[52]研究表明，腎臟IRI過程中HIF-1α可以通過減少miR-489的生成，增加細(xì)胞凋亡水平從而加重腎臟IRI損傷。Bhatt等[41]亦觀察到miR-687在小鼠腎臟IRI過程中受HIF-1誘導(dǎo)，并通過HIF-1/miR-687/PTEN信號通路在小鼠腎臟IRI過程中調(diào)控細(xì)胞凋亡。

6 小結(jié)與展望

腎臟組織不同類型的細(xì)胞可能在不同的腎臟疾病中受到影響。為了解miRNA發(fā)揮的具體病理生理作用，有必要確定在具體腎臟疾病的情況下表達(dá)此miRNA的細(xì)胞類型。具有條件性過度表達(dá)或基因敲除的轉(zhuǎn)基因動物模型可能是研究miRNA在腎臟疾病中的作用和調(diào)控的最佳模型。在一定條件下識別miRNA調(diào)控及其靶基因變化的意義是目前臨床難點(diǎn)，因為單個蛋白質(zhì)可以由多個miRNA調(diào)控，單個miRNA可以調(diào)節(jié)多個蛋白質(zhì)。雖然miRNA對腎臟IRI的調(diào)節(jié)是一個令人興奮的新興研究領(lǐng)域，但更重要的是需要建構(gòu)腎臟IRI過程中miRNA表達(dá)譜的變化，并完善miRNA-mRNA在腎臟IRI過程中的網(wǎng)狀對應(yīng)作用。最終，通過信號通路分析等明確每一個miRNA在腎臟IRI過程中的具體靶點(diǎn)、作用機(jī)制及病理生理影響。值得注意的是，目前鑒定出的大多數(shù)miRNA都是差異表達(dá)的，并可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖、自噬等來抑制損傷反應(yīng)，這可能為臨床指明了靶向調(diào)節(jié)腎臟IRI的新思路；同時也應(yīng)該注意到HIF與miRNA之間的相互作用等新的IRI機(jī)制成為研究熱點(diǎn)的可能性；其次，在腎臟IRI的研究中，使用生物信息學(xué)技術(shù)對miRNA進(jìn)行芯片檢測及通路分析的研究尚不豐富，芯片數(shù)據(jù)的檢測以及生物數(shù)據(jù)的挖掘?qū)砜赡艹蔀槟I臟病研究的熱點(diǎn)之一，也符合目前提倡的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)理念，期待在今后的腎臟IRI研究中看到更多相關(guān)研究。