脂多糖的作用機制與其在畜牧業的應用

劉 波 唐小懿 周麗媛 謝 亮 方熱軍

（1.湖南農業大學動物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南畜禽安全生產協同創新中心，湖南 長沙 410128；3.華農恒青科技股份有限公司，江西 南昌 330013）

1 脂多糖結構與生物學功能

1.1 脂多糖及其結構

脂多糖 （Lipopolysaccharides，LPS） 又稱內毒素，是大多數革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜的主要成分，也存在于梳狀菌數等少數革蘭氏陽性細菌中，易被胃腸道吸收入循環系統。LPS的分子質量為2～20ku，能夠提高細菌質膜負電性，增加質膜穩定性，保護質膜免受外界攻擊。LPS主要由O-抗原、核心寡糖和脂質A組成，與磷脂類似有一親水頭和疏水頭。核心寡糖在中間連接位于外層具有親水結構的O-抗原和位于內層具有疏水性的類脂A。其中核心寡糖是由9～10個糖基組成的分枝寡糖鏈，又可被進一步劃分為內核心寡糖與外核心寡糖。內核心寡糖通過酸不穩定的酮苷鍵將核心寡糖附著于脂質A。外核心寡糖主要由中性和堿性己糖組成，與O-抗原連接，其在不同菌株中存在單糖組成和構型上的差異，是決定LPS核心型的基礎。脂質A是LPS生物活性中心和主要的毒性成分，是先天性免疫應答的有效刺激物，它由2個葡萄胺、磷酸鹽和一定量的脂肪酸構成，高度保守，同一菌種的類脂A結構基本保持一致。O-抗原多決定LPS的抗原性，保護細菌免受抗生素的危害和抵抗補體系統的溶解作用，是由一定長度的寡糖單位首尾相連而行成的不同聚合度的聚合物，結構不穩定。根據脂多糖中是否含有O-抗原，可將脂多糖分為含有一定數量O-抗原的光滑型脂多糖 （Smooth-LPS，S-LPS）和缺乏O-抗原僅由類脂A與核心寡糖組成的粗糙型脂多糖 （Rough-LPS，RLPS）。

1.2 脂多糖的提取

脂多糖的提取方法目前至少有18種。如煮沸法、超聲波法、苯酚-氯仿-石油、100°C水提取、脂、多糖試劑盒提取方法、熱酚水法、丁醇提取、醚提取法、Hitchcock-Brown法等。目前最常用的方法是熱酚水法和醚提取法。熱酚水提取法適用S-LPS的提取，利用LPS可以溶于水相，蛋白質由于酚的作用變性沉淀而被去除，同樣溶于水相的核酸則通過核酸酶的消化來去除，從而得到純度較高的LPS。該方法的優點是提取LPS產量大且純度高，但操作復雜，需要的細菌量大，危險性較高。醚提取法更適合R-LPS，因為R-LPS不含親水的O-抗原，利用熱酚水提取法容易被萃取到酚相中，但其不溶于醚，從而可以實現R-LPS的提取。

1.3 脂多糖生物學作用

LPS在細菌正常生活狀態時不釋放，但在細菌菌體死亡破裂、人工方法裂解后釋放或細胞活躍生長繁殖時釋放出來，其本身無毒性作用，但其作為非特異性免疫原，當進入微循環后與宿主效應細胞 （主要為單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞）相互作用分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1）、白細胞介素2（IL-2）、白細胞介素6（IL-6）、 活性氧自由基 （ROS）、NO等生物活性分子，引起機體發熱、彌散性血管內凝血、多器官機能衰竭及休克等臨床綜合癥。LPS的毒性是通過LPS在細菌周圍形成一層保護屏障以逃避抗生素的作用，作用于宿主細胞，產生炎性細胞因子，使機體內環境處于紊亂狀態，引起內毒素血癥、膿毒癥等疾病。LPS的活性主要因其具有免疫激活作用，可以抗腫瘤、抗輻射、抗感染、促進后發性白內障的發生、促進牙周炎癥、促進包細胞增生和緩解哮喘等多種生物學功能。

2 LPS作用機制

2.1 與LPS作用的相關受體

2.1.1 Toll樣受體 （Toll-Like Receptors,TLRs）

Toll樣受體屬于模式識別受體 （Patternrecognition Receptors,PRRs）家族，至今已發現10多種TLRs，其中TLR4是研究最多也是最主要的受體。研究表明，TLR4的識別范圍較窄，僅識別革蘭陰性菌和胞壁成份多糖 （LPS）。TLR4在LPS刺激后起著重要作用，誘導宿主防御機制，導致細胞內信號通路的激活和共刺激分子與細胞因子的產生。

2.1.2 脂多糖結合蛋白 （Lipopolysaccharide Binding Protrin,LBP）

脂多糖結合蛋白是一種Ⅰ型急性期反應蛋白，主要存在于人和動物血清中，對類脂A有高度的親和性，有磷脂轉運作用。LPS一般以多聚體的形式存在，但LPS的有效激活形式是LPS單體，LBP可以加劇LPS解離成單體。當前認為LBP的生物學功能具有濃度依賴性的雙重效應，低濃度時有促炎作用，高濃度則表現為抑制炎癥的效應。

2.1.3 CD14分子

CD14分子式LPS的關鍵受體之一，它的N段富含亮氨酸重復單位，有識別LPS的作用，且對LPS具有高親和性。CD14分子有兩種存在方式：：表達于髓源性細胞表面的膜CD14(mCD14)和血清中的可溶性 CD14（sCD14）。mCD14分子主要介導髓源性細胞，如單核巨噬細胞、中性粒細胞等。mCD14分子對LPS有高親和力，可以使極低水平的LPS誘導細胞產生強烈的反應；sCD14分子主要介導那些不表達mCD14的細胞，如內皮細胞、上皮細胞、樹突狀細胞等，對機體有雙重功效。CD14的主要生物學功能是識別、結合LPS或LPS-LBP復合物，進而激活效應細胞。

2.1.4 髓樣分化蛋白-2（Myeloid Differentiation protein-2,MD-2）

髓樣分化蛋白-2是一種可溶性的分泌蛋白，主要存在于單核巨噬細胞和淋巴細胞表面。在LPS介導的細胞反應中主要與TLR4的胞外區結合，形成TLR4-MD-2復合體幫助TLR4與LPSLBP-CD14三聯體的結合。

2.2 LPS誘導的TLR4信號通路

LPS參與細胞介導的應激反應時有2條不同的信號轉導通路。第1條是髓樣分化因子88（Myeloid Differentiation factor 88,MyD88） 承接的轉導途徑稱為MyD88依賴途徑依，第2條是由β干擾素TIR結構域銜接蛋白 （TRIF）聯接的信號通路被稱為MyD88非依賴途徑，兩者都由LPS和TLR4的關聯觸發。

LPS進入血液循環，LBP可以識別LPS，加快LPS解離成單體，使其內部結構暴露出來，并與其結合運送至髓源性細胞表面。髓源性細胞表面的CD14與之結合形成LPS-LBP-CD14三聯復合體，隨后LBP作為載體蛋白將其轉運至TLR4-MD-2蛋白復合體處，MD-2識別并與LPS結合形成TLR4-MD-2-LPS三聚體，激活TLR4跨膜信號通路。 （1）MyD88依賴途徑：TLR4被激活后，發生構象的改變和二聚化，將信號轉入細胞內，TLR4與MyD88的羧基端結合，MyD88通過其死亡域與IL-1受體相關激酶1（IL-1 Receptor-associated Kinase 1,IRAK1）的死亡域相結合，使IRAK1磷酸化。磷酸化后的IRAK1與腫瘤壞死因子受體相關因子6（TNF–α Receptor-associated Factor 6,TRAF6）結合并使其激活。TRAF6使IRAK1連接于NF-κB誘導激酶（NIK），NIK被激活后進一步激活NF-κB抑制蛋白 （IκB） 酶復合物 （IKKα， IKKβ）， 活化的IKK復合體作用于IκB，使IκB2個絲氨酸位點被磷酸化而降解。IκB降解后與NF-κB分離，導致NF-κB活化并遷移到到細胞核內，誘導炎性細胞因子的表達如TNF-α、IL-1、IL-6、環氧合酶-2（COX-2）、誘導型一氧化氮合酶 （iNOS）等，發揮致炎效應 [41-46]。 （2）MyD88非依賴途徑：TLR4被激活后其胞內區TIR結構域與Toll樣受體相關分子 （TRIF-related Adaptor Molecule,TRAM）相連，作用于TRIF使其活化并與TRAF6結合，然后將信號傳導至干擾素調節因子3（IRF-3），將其磷酸化后形成同源二聚體，轉位入核，誘導干擾素 （Interferon,IFN）基因表達，引發應激反應。

3 LPS在畜牧業的應用

LPS是目前所知十分有效的應激源，常在畜牧業中用來建立應激模型，模擬動物在實際生產中的應激。LPS不僅可以促進炎性細胞因子的產生，而且可誘導機體產生大量的自由基，導致機體發生免疫及氧化應激。雖然LPS刺激與實際飼養過程中活細菌誘導的應激反應不一樣，其建立的模型也不能完全模擬畜禽場中實際的應激反應，但是由于LPS模擬動物應激重復性好，因而被廣泛用于應激機理及營養干預研究。

3.1 免疫應激及模型建立

免疫應激是指畜禽機體受到外界微生物的攻擊，免疫系統被激活，產生免疫應答反應以抵抗微生物入侵。畜禽遭受免疫應激會出現嘔吐、氣喘、發熱、厭食、臥地不起等異常反應；IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α等炎性細胞增多，生產性能、免疫功能下降，甚至造成動物死亡，嚴重影響畜牧業生產和造成巨大的經濟損失。一般來說，炎癥反應是免疫應激的標志。免疫應激包含著復雜的生理反應，涉及 “神經—內分泌—免疫”等系統。神經系統通過其豐富的外周神經突觸及其分泌的神經遞質和一些內分泌激素，還有神經細胞分泌的細胞因子，來調節免疫系統的功能。免疫系統是通過細胞因子和激素樣物質反饋作用于神經內分泌系統。下丘腦—垂體—腎上腺軸 （HPA）是神經內分泌網絡系統中主要的應激軸。糖皮質激素是HPA軸的最終產物，一般認為免疫應激對動物免疫系統作用機制是由糖皮質激素介導的。腎上腺皮質束狀帶分泌的主要有皮質酮、皮質醇等，對免疫系統具有廣泛的作用。大量研究表明在畜禽機體注射LPS，可引起畜禽體溫升高，氣喘等表現，生產性能下降，前列腺素E2和皮質醇濃度增加、炎性因子白細胞介素1β （IL-1β）、 IL-2、 TNF-α 等含量增加， 成功建立免疫應激模型。

3.2 氧化應激及模型建立

畜禽機體內存在氧化系統和抗氧化系統，正常生理情況下它們處于動態平衡，當機體受到各種有害刺激時，體內ROS等高活性分子過量產生，超出機體自身抗氧化防御體系清除的能力，氧化與抗氧化狀態失衡，自由基在機體內積累，導致機體處于過氧化損傷的狀態，就叫做氧化應激。在正常情況下，機體代謝微量的ROS對細胞維持正常功能是有一定積極作用的，當處于氧化應激狀態，抗氧化保護系統不能很好的維持活性氧的產生和清除時，過多的ROS會誘導細胞損傷、凋亡和壞死，引發各種疾病，導致幼畜成活率低、畜產品品質下降等。機體中的抗氧化防御系統分為兩類物質：酶類抗氧化物質和非酶類抗氧化物質。酶類抗氧化物質通常包括：超氧化物歧化酶 （SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶 （GSHPx）、過氧化氫酶 （CAT）、硫氧化還原蛋白（TRX）等。非酶類抗氧化物主要包括：維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素、尿酸和谷胱甘肽（GSH）等。細胞中ROS有內源性和外源性兩種存在形式。內源性主要來自線粒體呼吸鏈和和胞質中NADPH氧化酶；而外源性ROS可由化學毒物和炎性細胞因子等產生。大量研究表明動物機體內注射LPS可引起脂質過氧化損傷物 （丙二醛）含量升高、血清和組織中抗氧化指標（SOD、GSH-Px、CAT）含量降低，產生ROS和O2-等，引起氧化應激。強烈而持久的氧化應激可能是因LPS刺激產生過度的免疫反應，交感-腎上腺髓質系統分泌大量的兒茶酚胺，兒茶酚胺氧化能產生有毒性的氧自由基，導致自由基在體內蓄積而引起細胞毒性，引發過氧化損傷。

3.3 抗應激營養添加劑

牛膝多糖是一種免疫調節劑，具有增強免疫，恢復免疫系統損傷的功能。朱惠玲等（2011）研究表明在對LPS刺激的仔豬日糧中添加500mg/kg牛膝多糖可以降低LPS刺激的豬炎性因子、前列腺素E2（PGE2）和皮質醇的含量，緩解了仔豬免疫應激神經內分泌的改變。魚油富含n-3多不飽和脂肪酸 （n-3PUFA）可以調控炎癥、免疫功能和神經內分泌系統。Yang等（2008）研究發現魚油可以提高LPS刺激下雞的飼料轉化率，降低NF-kB的mRNA的豐度，減少TNF-α、IL-6等炎癥因子的產生，提高血清IgG含量，從而緩解免疫應激。研究表明N-乙酰半胱氨酸 （NAC）可以提高抗氧化能力，緩解LPS應激導致的生長抑制，降低TNF-α，皮質醇、IL-6和前列腺素E2的濃度，緩解NF-kB和熱休克蛋白70（HSP70）蛋白水平的顯著升高，并且提高血漿表皮生長因子 （EGF）水平和腸表皮生長因子受體 （EGFR）mRNA。EGF作為一種促生長的活性多肽可以誘導細胞增殖分化，促進腸道發育，提高腸細胞吸收營養物質的能力。據此推測NAC可能通過促進EGF分泌，從而緩解LPS刺激造成的生長抑制及炎癥反應等。通過NF-kB信號通路影響炎性因子的表達，緩解免疫應激。谷氨酰胺 （GLN）是人體及其他哺乳動物中含量最豐富的一種游離氨基酸，可以維持和提高組織細胞內GSH含量，清除各種自由基和過氧化物對細胞的損害。李歡等 （2017）通過給斷奶仔豬腹腔注射LPS建立氧化應激模型，在飼料中添加1%GLN與應激組相比，降低了血清MDA、SOD、GSH-Px和CAT活性，提高了血清T-AOC的含量，腸粘膜谷胱甘肽過氧化物酶1（GPX1）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、鋅銅超氧化物歧化酶 （CuZnSOD）和錳超氧化物歧化酶 （MnSOD）基因相對表達量增多，從而緩解LPS引起的應激反應，提高仔豬的抗氧化能力。

4 小結

LPS作為大多數革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，其結構組成與細菌致病能力息息相關。大量的研究已經在LPS的結構特點、生物學作用和作用機制等方面取得了許多成果，但LPS激活的過程具有多種信號轉導途徑，涉及多個雙重作用的受體，是一個十分復雜的過程。目前LPS是建立應激模型最經典的方式，其對研究應激機理及應激條件下畜禽免疫功能、抗氧化功能、生產性能、物質代謝產生的影響，對于研發抗應激劑、減少應激的發生具有十分重要的實踐指導意義。但LPS建立的模型通常是急性應激模型，在實際生產中，畜禽的環境變化是相對較慢的，這種應激對畜禽所造成的也是屬于慢性的。而肌肉或者腹腔注射LPS引起的應激持續時間較短，大約為24h，而且應激效應還與注射的劑量存在明顯關系，如果多次注射LPS還可能會產生耐受性。雖然本文未對LPS建立應激模型的劑量進行總結比較，但不同物種對LPS的耐受能力是有很大的差別。因此在建立LPS應激模型時，應充分考慮動物對LPS的耐受能力，從而建立起注射劑量相當（既能引起免疫應激又不致死）和應激時間充分的應激模型。