白僵菌和綠僵菌不同菌株對馬尾松毛蟲的致病力

蔡守平，何學友，曾麗瓊，蘇文晶，陳文玉，陳世勇

(1.福建省林業科學研究院、福建省森林培育與林產品加工利用重點實驗室，福建 福州 350012； 2.泉州市森林病蟲防治檢疫站，福建 泉州 362000；3.泉州森林公園管理處，福建 泉州 362000； 4.泉州臺商投資區科技經濟發展局，福建 泉州 362100)

馬尾松毛蟲(Dendrolimuspunctatus)是我國南方松林中的歷史性害蟲，僅福建省每年發生面積達數萬公頃，造成了重大損失[1]。自20世紀50年代在福建、廣東等省開始應用球孢白僵菌(Beauveriabassiana)防治馬尾松毛蟲，70年代在南方各省廣泛應用，數十年來白僵菌成為了馬尾松毛蟲防治的主要手段，在松林的防災減災中發揮了重要的作用[2-3]。前人篩選出對松毛蟲具有高致病力的優良白僵菌菌株，為馬尾松毛蟲的高效防治提供了基礎[4-7]，也有學者嘗試將金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)應用于防治馬尾松毛蟲，并取得了一定的成效[8-9]。然而，不同的白僵菌和綠僵菌菌株對靶標害蟲的致病力存在著顯著的差異[4，10-11]，同時菌株在長期的傳代培養中也會出現菌株退化、致病力下降等問題[12-14]。因此，不斷篩選高致病力和定向培育優良菌株是白僵菌和綠僵菌應用中重要內容之一，也是保持和提高白僵菌和綠僵菌對靶標害蟲防治效果的重要手段[14]。本文比較了不同來源的白僵菌和綠僵菌菌株對4～5齡馬尾松毛蟲幼蟲的致病力，旨在對馬尾松毛蟲的生產性防治提供新的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

供試的馬尾松毛蟲4～5齡幼蟲于2015年4月上旬采集于福建省泉州臺商投資區張坂鎮，試蟲采回后放入養蟲籠中以新鮮馬尾松針葉飼養1 d后，選取健康的幼蟲用于生物測定。

1.2 供試菌株

供試菌株為4株金龜子綠僵菌和7株球孢白僵菌，除MaV275、Ma4556綠僵菌菌株由英國同行贈送外，其他菌株均由福建省林科院森保所研究人員從福建福州、安溪等地林間采集、分離、保存。所有菌株均保存于福建省林科院。供試菌株信息見表1。

1.3 不同菌株菌落生長速度及產孢量的測定

不同菌株的生長速度測定參考蔡守平等[11]的方法，以中心接種的方式將不同菌株接種于PPDA平板培養基中心，然后置于(25±1) ℃的恒溫培養箱中培養，用十字交叉法每5 d測量1次菌株直徑(以縱橫直徑的平均值作為菌落直徑)，15 d后待菌落產孢充分后以打孔器在菌落上取一定面積的菌落，使用0.03%的吐溫-80溶液進行稀釋，最后用血球計數板計數并換算成單位面積的產孢量。每個菌株設置3個重復，產孢量測定每個菌落取3個菌落塊，共重復9次。

表1 供試菌株及來源

1.4 不同菌株對馬尾松毛蟲幼蟲的致病力比較

從各菌株的菌落表面刮取分生孢子置于無菌水中，加入少量吐溫-80溶液充分振蕩，通過梯度稀釋的方法，配制成5×107孢子·mL-1的孢子懸浮液，用于接種準備好的馬尾松毛蟲幼蟲。接種時，將養蟲籠中的馬尾松毛蟲用鑷子小心取出，在孢懸液中浸漬5 s，然后單頭放置于表面消毒過的養蟲盒中，并以新鮮馬尾松針葉飼養，將接種后24 h內死亡的幼蟲剔除，每菌株最終接種數量見表3(因孢子懸浮液配制偏少，球孢白僵菌BbAX-02菌株接種20頭)，接種后在22～27 ℃的室溫條件下飼養，隔天換針葉，統計死亡情況，蟲死后進行保濕培養觀察各菌株感染情況。用無菌水接種作為對照。生物測定試驗于2015年4月在福建省林科院森保所實驗室完成。

1.5 數據分析

菌株菌落生長和產孢量數據使用SPSS軟件分析，多重比較使用Ducan′s法，生物測定數據應用DPS數據處理系統進行統計分析，時間—死亡率機率值分析法建立致病力回歸方程，估算致死中時(LT50)[15]。

2 結果與分析

2.1 不同菌株的菌落生長與產孢情況比較

不同綠僵菌、白僵菌菌株的菌落生長與產孢情況見表2。各菌株的菌落直徑間存在顯著差異，菌落直徑較大的是球孢白僵菌BbPT-01、BbTA-01菌株和綠僵菌MaFZ-04、MaV275菌株，培養15 d后菌落直徑均超過6 cm；而菌落直徑較小的為球孢白僵菌BbHA-10、BbHA-01菌株，培養15 d后菌落直徑分別為3.70、2.94 cm。各菌株的產孢量間也存在顯著差異，其中以球孢白僵菌BbAX-04菌株、金龜子綠僵菌MaMXTR-01、Ma4556菌株產孢量較大，超過1.2×108孢子·cm-2；產孢量最小的是綠僵菌MaV275菌株和白僵菌BbFZ-11菌株。分析發現，各菌株的菌落直徑和產孢量之間的相關性并不明顯。

表2 不同菌株的菌落直徑及產孢量

2.2 不同白僵菌、綠僵菌菌株對馬尾松毛蟲幼蟲的致病力比較

圖1 馬尾松毛蟲幼蟲接種不同白僵菌、綠僵菌累積死亡率變化

不同菌株的孢子懸浮液接種4～5齡馬尾松毛蟲幼蟲后，其累積死亡率變化見圖1。從圖1可知，馬尾松毛蟲幼蟲接種不同菌株后的累積死亡率差異較大。接種白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株的累積死亡率較高，死亡速度也快，接種12 d后，馬尾松幼蟲累積死亡率分別達到100%、90%，遠比其他菌株高。接種20 d后，除白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株外，其他菌株的累積死亡率最高為66.7%(白僵菌BbTA-01)，最低僅為15%(綠僵菌MaMXTR-01)。

通過時間—死亡率機率值分析法建立各菌株對馬尾松毛蟲幼蟲的致病力回歸方程，結果見表3。各回歸方程的相關系數均大于0.9，P值均大于0.05，表明所建立的回歸方程是可信的。根據回歸方程估算出各菌株對馬尾松毛蟲幼蟲的致死中時(LT50)，白僵菌中BbAX-02、BbAX-04菌株的LT50最短，分別為7.25、7.42 d；其次是BbTA-01菌株，為13.02 d。綠僵菌中LT50最短的是Ma4556菌株，LT50為13.67 d；其他菌株LT50均大于15 d，致病力較差。從感染率上來看，也是BbAX-02、BbAX-04菌株最高，分別為95%、90%，比其他菌株高。

表3 不同菌株對馬尾松毛蟲幼蟲的致病力

3 討論

不同來源白僵菌、綠僵菌的菌株對靶標害蟲的致病力存在顯著差異，也就是說存在一定的寄主專化性。因此，在應用白僵菌、綠僵菌進行生物防治時，篩選出對靶標害蟲致病力強的菌株是重要的基礎工作。本研究中，分離自馬尾松毛蟲幼蟲的白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株對4～5齡馬尾松毛蟲的致死率高，致死速度快，LT50分別為7.25、7.42 d，比其他菌株時間短，可見這2個菌株對馬尾松毛蟲的致病力最強，可作為優良的生產菌株生產出產品，用于馬尾松毛蟲的林間防治。

蟲齡是影響白僵菌、綠僵菌對靶標害蟲致病力的重要因素，一般蟲齡越小致病力越強[16-17]。馬尾松毛蟲一般6齡結繭化蛹[18]，因采集時間原因，本研究中使用的試蟲為4～5齡馬尾松毛蟲幼蟲已屬于大齡幼蟲，從致病力測定結果來看，僅白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株的LT50在7 d左右；其余的菌株均超過10 d，而其中7個菌株甚至超過了15 d，說明致病力較差。其原因可能是由于菌株本身致病力的差異，也有可能是試蟲的蟲齡較大造成的[16-17]。因為蟲齡大，其自身的抗性較強[16-17]。王義勛等[7]篩選出的高致病力白僵菌菌株對3齡馬尾松毛蟲幼蟲LT50分別為7.63、7.62、7.88 d，與本研究中篩選出的高致病力菌株的LT50相近，可見本研究中篩選出的優良菌株對馬尾松毛蟲幼蟲致病力較高。

雖然本試驗篩選出了致病力較高的優良菌株，但其快速致死效應并不顯著，這也是生物制劑應用經常被詬病的問題[19-20]。因此，在篩選高致病力菌株的基礎上，進一步研究白僵菌制劑與高效低毒農藥的復配劑，提高殺蟲速度同時增加白僵菌的侵染率，達到增效的目的，是一個重要的研究方向，不同學者在這方面已經開展了一些有意義的工作[19-20]。