揉搓與稀堿聯合預處理對水稻秸稈酶解產糖率及結構的影響

馬賢武，王 凱，劉 軒，榮昭強，李曉林，劉玉濤

(南京農業大學工學院/江蘇省智能化農業裝備重點實驗室，江蘇 南京 210031)

秸稈的資源化利用是解決中國秸稈過剩問題的根本途徑[1]。目前中國主要農作物秸稈理論資源量為 1.04×109t，其中水稻秸稈為 2.99×108t；但由于農村能源結構的改變和各類替代燃料的應用，加上秸稈資源分布零散、體積大、收集運輸成本高，以及綜合利用經濟效益差，產業化程度低等原因，導致秸稈出現了地區性、季節性、結構性過剩，對生態環境造成極大的威脅，因而尋求秸稈的合理利用方式已迫在眉睫。

水稻秸稈主要成分為纖維素、半纖維素和木質素，其表面覆蓋有蠟質層和硅質層，使得纖維素難以被降解利用。通過預處理打破秸稈的復雜結構是提高其利用有效性的重要手段。預處理方法主要有物理預處理、化學預處理、生物預處理以及聯合預處理等。物理預處理能夠減少秸稈的尺寸、增大與反應物的接觸面積[2]且不會產生后續反應的抑制物[3]，有利于乙醇和甲烷產量的提升，但其能耗較高導致經濟上不可行[4]；化學預處理的效率較高，但容易導致半纖維素的損失，抑制物產生和二次污染[3]。因而，能否針對水稻秸稈的特點，部分破壞其表面結構，從而減少預處理的能源消耗和降低后續化學預處理堿的用量，值得研究。

前期研究發現單獨揉搓預處理后水稻秸稈的硅質層遭到破壞，為后續厭氧發酵產氣提供了良好的條件，但其酶解還原糖產量卻沒有得到明顯提升。因而，本試驗將利用揉搓后聯合稀Ca(OH)2溶液對水稻秸稈進行預處理，研究其對酶解還原糖產生率及硅質去除率、結晶度和化學成分的影響，旨在為水稻秸稈高效資源化利用提供一種環境友好且可大規模應用的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用江蘇省南京市六合區收獲的水稻秸稈為材料，測得其總固體質量濃度(TS)為90.02%，揮發性固體質量濃度(VS)為76.84%，灰分含量為14.08%。對照秸稈自然風干后剪成 2～3 cm小段備用，揉搓處理秸稈通過機器處理后獲得。

化學試劑：試驗中的化學試劑均購自上海晶純生化科技股份有限公司，均為分析純。

1.2 試驗儀器

紫外分光光度計(UV-2008)由尤尼柯上海儀器有限公司生產，X射線衍射儀(X’Pert PRO)由荷蘭帕納科公司生產，傅立葉變換紅外光譜儀(Nicolet iS10型)由賽默飛世爾科技(中國)有限公司生產。

1.3 水稻秸稈的預處理方法

1.3.1 揉搓預處理 揉搓預處理機的工作原理如圖1所示。水稻秸稈進入喂入口后，受到喂入口處錘片的打擊，被打斷、打折的秸稈受到錘片的抓取和氣流的抽吸雙重作用，被帶入揉碎室，進入揉碎室內的物料受到錘片和齒條的沖擊、揉搓以及揉碎室內的流場作用，被逐漸加工成絲段狀，最后推送至拋送口處，被拋出揉搓機。

圖1 揉搓預處理機示意圖Fig.1 Working principle diagram of the rubbing pretreatment

1.3.2 揉搓與稀堿聯合預處理 將揉搓過的水稻秸稈采用稀Ca(OH)2溶液處理，設置Ca(OH)2質量濃度、處理時間和處理溫度3個試驗因素，分別取2%、4%、6%，6 d、7 d、8 d和20 ℃、40 ℃、60 ℃ 3個水平,進行正交試驗。將反應后的樣品用鹽酸中和至中性，洗凈過濾，保留固體殘渣，放入105 ℃烘箱中烘干后粉碎，分別用40目、60目、200目標準篩篩選出所需粒度的樣品，密封常溫備用。

1.3.3 稀堿預處理 根據正交試驗得到的最佳質量濃度、時間及溫度組合條件處理原始秸稈。反應后的處理步驟與方法1.3.2相同。

經過以上預處理，得到了原始秸稈、揉搓秸稈、稀堿處理原始秸稈、稀堿處理揉搓秸稈4個不同的處理樣品，分別記為原始、揉搓、原始+堿、揉搓+堿。

1.4 性能測試表征及檢測方法

1.4.1 酶解還原糖的檢測 精確稱取不同預處理之后過60目篩的水稻秸稈樣品0.2 g，放入錐形瓶中，并加入20 mg纖維素酶，以pH=4.8 NaAc-HAc緩沖液定容至50 ml，混勻后置50 ℃恒溫水箱中反應48 h。本研究選用3，5-二硝基水楊酸法檢測水稻秸稈酶解后還原糖產量[5]。酶解還原糖產生率=還原糖產量/水稻秸稈的質量×100%；酶解還原糖提高率=(處理秸稈酶解還原糖產生率-對照秸稈酶解還原糖產生率)/對照秸稈酶解還原糖產生率。

1.4.2 水稻秸稈硅去除率檢測 硅含量檢測方法參照文獻[6]、[7]。精確稱取不同預處理之后過60目篩的水稻秸稈樣品0.1 g，放入50 ml離心管中，加入3 ml質量比為50%的NaOH消化液，使用渦旋振蕩器混合均勻，保證消化液充分浸潤水稻秸稈，放入立式壓力蒸汽滅菌器中121 ℃消化20 min后，使用定性濾紙過濾并定容至50.0 ml，在20.0 ml試管中依次加入5.4 ml去離子水、400.0 μl樣品溶液、3.0 ml 0.26 mol/L鹽酸和400.0 μl 10%鉬酸銨，均勻混合后靜置5 min，再依次加入還原劑20%酒石酸溶液400.0 μl和400.0 μl 2%抗壞血酸溶液，均勻混合后靜置25 min，紫外分光光度計預熱20 min后，在600 nm波長處比色皿測定。最后根據不同質量濃度硅標準液吸光度結果所擬合出來的標準曲線求出各吸光度對應的硅含量。硅去除率=(處理秸稈硅含量-對照秸稈硅含量)/對照秸稈硅含量。

1.4.3 X射線衍射光譜分析 取不同預處理之后的過60目篩水稻秸稈樣品，均勻放入玻片凹槽中壓實，用X射線衍射儀進行掃描。測試條件：銅靶，λ=0.154 mm，管壓40 KV，電流40 mA，掃描步長0.02°，掃描范圍 10～45°。纖維素的結晶度(CrI)一般參照Segal經驗法[8]計算：CrI=[(I002-Iam)/I002]。式中：I002表示2θ在22°和23°之間的最大衍射強度；Iam表示2θ在18°和19°之間的最小衍射強度。

1.4.4 FTIR紅外光譜分析 取不同預處理之后的過200目篩水稻秸稈，加入約為樣品質量100倍的KBr(溴化鉀)于研缽中，混合均勻后研磨20 min，放入YB-2壓片機中制備試樣，再利用傅立葉紅外光譜儀掃描試樣。掃描次數：16次，掃描區間：4 000～500 cm-1。根據所得到的紅外光譜分析不同預處理后秸稈內部官能團的變化。

1.4.5 不同處理水稻秸稈的成分分析 不同處理水稻秸稈中纖維素、半纖維素和木質素的含量測定參考美國國家可再生能源實驗室的方法[9]。

1.5 數據處理

2 結果與分析

2.1 揉搓與稀堿聯合預處理對水稻秸稈酶解產糖率的影響

2.1.1 稀堿處理揉搓秸稈的最佳工藝條件 以酶解產糖率為指標，通過正交試驗得出稀堿處理揉搓水稻秸稈的最佳工藝條件。正交試驗的設計及結果分析如表1所示。

根據表1中的極差值(R)的大小分析，可知影響酶解產糖率的因素強度從大到小依次為：處理時間、稀堿質量濃度、處理溫度。且根據表中K值可推導出最佳預處理條件：即Ca(OH)2質量濃度6%、處理溫度60 ℃、處理天數8 d。為了驗證試驗數據的可靠性，在得到的最佳預處理條件下進行3組平行驗證試驗，測得其酶解產糖率為 33.67%，均高于正交實驗表中的9組數據。但發現正交試驗表中第4組[處理溫度40 ℃、Ca(OH)2質量濃度6%、處理時間6 d]，其酶解產糖率為 33.62%，與最佳預處理條件酶解產糖率無顯著性差異。從經濟成本和能源消耗角度出發，第4組所消耗的成本要比最佳組合小的多，故選擇第 4組為最優預處理條件。

表1揉搓秸稈稀堿預處理酶解產糖率正交試驗結果

Table1Theorthogonaltestresultsofenzymatichydrolysissugaryieldbyrubbing-alkalipretreatment

序號處理溫度(℃)稀堿質量濃度(%)處理時間(d)酶解產糖率(%)1202630.36 2204730.49 3206831.10 4406633.635402726.91 6404831.68 7604631.07 8606730.57 9602833.07 K191.9590.3495.06 K292.22 93.24 87.97 K394.7195.3095.85 K—130.65 30.11 31.69 K—230.74 31.08 29.32 K—331.57 31.77 31.95 極差(R)0.92 1.66 2.63

2.1.2 不同預處理對水稻秸稈酶解產糖率的影響 為了驗證稀堿與揉搓聯合預處理的有效性，分別測定了原始秸稈、揉搓秸稈、原始秸稈+堿[處理溫度40 ℃、Ca(OH)2質量濃度6%、處理時間6 d]、揉搓秸稈+堿[處理溫度40 ℃、Ca(OH)2質量濃度6%、處理時間6 d]4種預處理秸稈酶解還原糖產量，結果如表2所示。

由表2可以看出，經過揉搓預處理后的水稻秸稈酶解產糖率與原始秸稈間沒有顯著差異(P>0.05)，這與前期的試驗結果一致。經過稀堿預處理后的秸稈酶解產糖率為29.86%，較未處理的原始秸稈提升了61.41%，說明稀堿破壞了水稻秸稈的內部結構，提高了纖維素的降解率。揉搓和稀堿聯合預處理的水稻秸稈酶解產糖率得到進一步提升，達到了33.63%，與稀堿處理秸稈及揉搓秸稈的酶解產糖率都有顯著差異(P<0.05)，較原始秸稈提升了81.76%，說明揉搓預處理能夠加強稀堿預處理的作用效果。

2.2 不同預處理對水稻秸稈硅去除率的影響

分別測定了4種預處理情況下水稻秸稈的硅含量，結果如表3所示。水稻秸稈外表面附有一層硅，不僅是疏水性的，而且堅固，能夠有效保護內部的木質纖維素結構。因此打破水稻秸稈的硅保護層，使得水稻秸稈木質纖維素結構暴露出來，可以大幅提升水稻秸稈的利用率。通過對硅去除率的分析，可以初步了解揉搓與稀堿聯合預處理的作用機理。

表2不同預處理對水稻秸稈酶解產糖率影響

Table2Effectofdifferentpretreatmentsonyieldofenzymatichydrolyzedreducingsugarofricestraw

處理方式 酶解產糖率(%)酶解還原糖提高率(%)原始秸稈18.50±0.15a0揉搓秸稈19.60±0.30a5.95原始秸稈+堿29.86±1.95b61.41揉搓秸稈+堿33.63±0.74c81.76

同一列數據后不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

由表3可以看出，揉搓預處理可以有效去除水稻秸稈表面的硅質層，其硅去除率可達33.40%，而稀堿對硅去除率影響不明顯，該結果可以解釋揉搓與稀堿聯合預處理的作用機理，即揉搓預處理使水稻秸稈表面的硅質保護層被破壞，從而使稀堿更好地作用于內部的木質纖維素，提升了木質纖維素的利用率。

表3不同預處理對水稻秸稈硅去除率的影響

Table3Effectofdifferentpretreatmentsonremovalratioofsiliconofricestraw

處理方式 水稻秸稈硅含量 (%)硅去除率(%)原始秸稈9.96±0.08b0揉搓秸稈6.63±0.13a33.40原始秸稈+堿9.57±0.13b3.92揉搓秸稈+堿6.17±0a38.05

同一列數據后不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.3 不同預處理對水稻秸稈結晶度的影響

纖維素是構成水稻秸稈木質纖維素的主要成分，其具有結晶區和無定形區兩相結構。而纖維素的結晶度是指結晶區占纖維素整體的百分比[10]。因此，常用X射線圖譜來分析研究纖維素的結晶程度。

不同預處理后的水稻秸稈XRD圖譜和結晶度如圖2所示。經過不同預處理之后，XRD圖譜中各衍射峰的位置基本沒有改變，只是衍射峰的強度有所差異。相比于原始秸稈和揉搓秸稈，經過稀堿處理后的水稻秸稈其衍射峰強度在040和002處都明顯升高，說明稀堿預處理可以使水稻秸稈結晶區的有序性得到提升。根據結晶度計算結果可以看出，經過堿處理的原始秸稈和揉搓秸稈，其結晶度都得到了有效提升，且4種預處理方式中，揉搓與堿聯合預處理組結晶度最高，相比于原始秸稈結晶度由42.47%提升至54.31%。這是由于經過揉搓和稀堿聯合預處理后，水稻秸稈中位于無定形區的木質素和半纖維素部分被溶出降解[11]，使纖維素的相對含量增加，從而提升了水稻秸稈的結晶度。

圖2 不同預處理后水稻秸稈的XRD圖Fig.2 X-ray diffraction spectra of rice straw by different pretreatments

2.4 不同預處理后的水稻秸稈紅外光譜分析及成分分析

秸稈的纖維素和木質素含量能夠有效反映預處理的效果和解釋酶解產糖率高低的原因，因而對不同預處理水稻秸稈的成分和FTIR紅外光譜進行了分析，結果如表4和圖3所示。

由表4可知，揉搓預處理使得水稻秸稈纖維素的相對含量由29.35%提升到35.46%，而木質素相對含量由23.82%降低到18.38%；加堿預處理能夠大幅提高纖維素的相對含量和降低木質素的相對含量，分別提高或降低到42.58%、11.88%；揉搓預處理能夠加強稀堿的作用效果，水稻秸稈揉搓后聯合稀堿預處理的纖維素相對含量由未揉搓原始秸稈稀堿處理的42.58%提高到47.51%，木質素含量略有降低。

圖3為不同預處理后水稻秸稈的紅外光譜圖，可以看出，不同預處理的圖譜形狀大致相似，但部分特征峰的吸收強度發生了變化，這表明，經過不同預處理后，水稻秸稈化學組分相對含量發生了變化。在波數3 420 cm-1處為羥基(-OH)基團伸展振動吸收峰，各處理在此波數下吸收峰強度較原始秸稈明顯減弱，其中揉搓和稀堿聯合預處理之后吸收峰強度最弱，這說明經過揉搓和稀堿聯合預處理后，水稻秸稈中氫鍵斷裂，纖維素、半纖維素和木質素之間的連接被破壞。在1 595 cm-1和1 510 cm-1處為木質素收縮振動吸收峰[12]，可見揉搓和稀堿聯合預處理之后該特征峰相對吸收強度與其他3組相比明顯減弱，說明木質素得到了有效去除，這與表4所得到的結果相符合。

通過不同預處理水稻秸稈的光譜和成分分析，可知揉搓和稀堿聯合預處理有利于木質素相對含量的降低和纖維素相對含量的提升，從而有利于酶解還原糖含量的提高。

表4不同預處理對水稻秸稈成分的影響

Table4Effectofdifferentpretreatmentsoncompositionofricestraw

處理方式 纖維素含量 (%)半纖維素含量 (%)木質素含量 (%)原始秸稈29.3520.7423.82揉搓秸稈35.4623.2018.38原始秸稈+堿42.5822.1111.88揉搓秸稈+堿47.5123.6411.30

圖3 不同預處理后水稻秸稈的紅外光譜圖Fig.3 Flourier transformation infrared spectroscopy spectra of rice straw by different pretreatments

3 討 論

揉搓和稀堿預處理具有良好的協同作用。揉搓和稀堿聯合預處理后秸稈酶解產糖率為33.63%，硅去除率達38.05%，可以明顯提高秸稈的結晶度，有效破壞木質素的束縛作用，是一種適于大規模應用的高效的秸稈預處理方式。

結合酶解產糖率和經濟成本等因素考慮，獲得秸稈揉搓后Ca(OH)2處理的最佳工藝參數為：Ca(OH)2質量濃度6%，處理溫度40 ℃，處理天數6 d。

水稻秸稈經過揉搓預處理之后，其表面硅去除率可達到30%以上。而稀堿預處理可以使秸稈中木質素和半纖維素分子間酯鍵發生皂化反應，使得纖維素、半纖維素和木質素間的交叉連接作用減弱，從而使木質纖維原料的孔隙度增加[13]。結合酶解產糖率結果來看，只經過揉搓預處理對水稻秸稈酶解產糖率作用效果不明顯，但可以增強后續稀堿處理的作用效果，在相同的稀堿處理條件下，經過揉搓處理的秸稈相比于原始秸稈，其酶解產糖率得到了有效的提升。從X射線衍射光譜、FTIR光譜和秸稈成分測定結果來看，水稻秸稈經過揉搓和稀堿預處理后木質素得到明顯去除，纖維素的相對含量得到了進一步提升，前人研究發現，纖維原料中的木質素對纖維素酶與底物的接觸形成立體阻礙，同時還能夠非特異性吸附纖維素酶[14-15]，而揉搓與稀堿聯合預處理，能有效去除秸稈表面硅質和內部的木質素，使纖維素酶更好地作用于纖維素，從而提高了水稻秸稈木質纖維素的利用率。揉搓與稀堿聯合處理的協同作用效果，與唐洪濤等[16]發現的較低劑量γ射線輻照(0～200 kGy) 可以大幅降低后續堿浸泡處理所需的用量和時間有一定的相似性，但相比于γ射線輻照和稀堿結合處理以及張婷[17]所采用的超聲波和稀堿聯合預處理手段，揉搓與稀堿聯合預處理的處理條件比較溫和，所需的經濟成本也更少，可以作為水稻秸稈大規模高效資源化利用的方式。

本試驗采用Ca(OH)2作為代表性堿，缺乏揉搓與其他堿協同作用效果的比較研究，另外如何有效地將試驗廢液中的Ca2+回收利用，有待于進一步研究。