云粳系列水稻品種分子身份證的構建

管俊嬌，楊曉洪，王江民，張 鵬，黃清梅，白 潔，余志慧，張建華

(1.云南省農業科學院質量標準與檢測技術研究所，云南 昆明 650205；2.云南省農產品質量安全中心，云南 昆明 650223；3.云南省農業科學院農業經濟與信息研究所，云南 昆明 650205)

得天獨厚的自然環境造就了云南省豐富的稻種資源，同時多樣的民族文化又不斷促進稻種資源的豐富和發展，使云南省成為中國栽培稻的遺傳多樣性中心[1-2]。利用豐富的水稻資源選育出了大量優良品種，其中以高產、優質、抗病、抗倒伏為特點的云粳系列新品種在云南省及周邊省份得到了大面積推廣應用。但隨著品種數量的增多和頻繁的種質交流，種子市場中的“多、亂、雜”現象和“品種同質化”現象并存，制假、售假事件時有發生，使國家和農民利益受到很大的損害，給品種管理和知識產權保護帶來諸多困難。因此，快速、準確地鑒別品種顯得尤為重要。

傳統的品種鑒定方法為田間種植鑒定，主要依據形態學性狀對品種進行鑒別區分。DNA分子標記技術由于不受環境條件的影響，可從分子水平上對品種的遺傳特異性進行快速、準確地鑒定，克服了傳統形態標記鑒定周期長、誤差大、性狀差異小的缺點[3-6]。其中SSR標記因具有多態性高、重復性好、共顯性遺傳和易于檢測等優點[7]，被植物新品種保護聯盟(UPOV)生物化學和分子技術工作組用作植物新品種保護最廣泛應用的標記體系，也被廣泛用于作物多樣性分析及構建指紋圖譜[8]。

作物分子身份證是品種特異識別的一個標準，以分子標記的多態性檢測手段為基礎，將 DNA 指紋進行數字化編碼賦值[9]，利用最簡引物組合實現作物種質資源最大程度區分[10]。自2007年起陸續開展了大豆[11-13]、桃[14]、高粱[15]、甘藍型油菜[16]、梨[17]、蘿卜[18]、葡萄[19]、蘋果[20]等作物分子身份證的研究工作。在水稻方面，陸徐忠等[21]、顏靜宛等[22]利用 SSR 標記分別構建了水稻雜交種或親本材料的分子身份證，這些研究對水稻品種資源評價、利用和保護等起到了重要作用。但是對于遺傳背景較相似的一系列品種的分子身份證構建還未見報道。

本研究以云南省農業科學院選育的35份云粳系列水稻品種為研究材料，采用SSR 分子標記技術和熒光測序技術建立云南省粳稻品種指紋圖譜，篩選最佳引物組合，構建35份云粳系列水稻品種的分子身份證，以期用最簡引物組合實現品種的最大程度區分，減少繁復的工作量和高昂的檢測成本，為云粳系列水稻品種的快速識別提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取云南省7個育種單位近年來育成的163份粳稻品種、品系作為試驗材料，其中包括35份云粳系列水稻品種。

1.2 DNA的提取

每份試驗材料取100 粒種子，經催芽播種于苗床上，在塑料大棚內進行育苗。當幼苗長到四葉一心時，混合取20個單株的葉片，用改良的CTAB法[18]提取DNA。

1.3 SSR標記檢測

依據國家農業行業標準[23-24]公布的水稻微衛星遺傳標記，經過初篩選，在每條染色體上均勻選擇1～3對，共30對SSR熒光標記引物用于遺傳多樣性檢測。PCR總反應體系為10 μl，采用2×Mix混合液，10.0 μl的反應體積包括5.0 μl 2×Mix混合液、0.6 μl 5 μmol/L正向引物、0.6 μl 5 μmol/L反向引物、1.0 μl樣品DNA、2.8 μl超純水。擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環30次；72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。

擴增產物在毛細管熒光電泳系統AB 3730XL DNA 分析儀(Applied Biosystems，USA)上檢測。用GeneMapper Ver.3.7(Applied Biosystems，USA)對原始數據進行統計和校正，讀出每個位點每個樣品的等位變異片段大小數據。

1.4 品種分子身份證的構建

用POWERMARKER Version3.25軟件分析供試材料指紋圖譜數據，獲得引物多態性，并按非加權配對法(UPGMA)采用Nei’s遺傳距離進行聚類分析。篩選出鑒別云粳系列水稻品種的核心引物，讀取云粳系列水稻品種的核心SSR熒光標記的指紋數據，并對指紋數據進行數字化編碼。再結合品種的基本信息利用二維碼生成軟件將編碼字符串轉化成每份材料獨特的條碼標識即分子身份證。

2 結 果

2.1 云南省粳稻品種SSR標記多態性

用30對SSR引物，對163份粳稻品種進行遺傳多樣性檢測。檢測結果(表1)表明，30個多態性位點共檢測到等位基因207個，每對引物等位基因變幅為2～17，平均等位基因數為6.6。基因多樣性指數變異范圍為 0.024 4～0.823 9，平均為0.479 8；多態信息含量(PIC)的變異范圍為 0.02～0.80，平均為0.44。其中，在RM8277、RM336、RM72、RM297和RM219等位點所檢測到的多態信息指數較大。

表1云南省粳稻品種SSR標記遺傳多樣性參數

Table1ThegeneticdiversityparametervaluesofSSRmarkersinjaponicaricevarietiesfromYunnanprovince

位點 染色體等位基因數基因多樣性指數多態信息含量(PIC)RM583160.510.46RM208250.710.65RM8277390.800.77RM471450.630.58RM274520.020.02RM190670.590.51RM3367140.820.80RM728120.740.71RM278950.150.15RM2581040.100.09RM2241150.460.39RM191260.140.14RM1160.700.65RM423260.620.56RM85330.460.39RM5514100.720.68RM267570.520.41RM253660.540.44RM432750.630.56RM331850.090.09RM219960.730.69RM3111040.210.19RM2091170.510.48RM171240.590.51RM13067130.710.67OSR28970.530.49RM2971170.750.73RM2221080.330.31RM2541180.700.65RM71021250.480.42

分子身份證的構建既要滿足唯一性和可識別(鑒別)性，又要滿足最簡引物組合的要求，否則將會造成構建的分子身份證過于冗繁。因此，有必要單獨對云粳系列水稻品種的指紋圖譜進行分析，篩選可以區分供試品種的最簡引物組合。云粳系列水稻品種SSR標記多態性分析結果(表2)顯示，30對SSR引物在35份材料中共檢測到等位基因133個，每對引物檢測到的等位基因數為1～9個，平均為4個。基因多樣性指數變異范圍為0～0.74，平均為0.40；多態信息含量(PIC)的變異范圍為 0～0.72，平均為0.36。在RM8277、RM336、RM1、RM551 、RM219 、RM1306和RM254等位點所檢測到的遺傳多樣性參數值較大。對比表1和表2可知，對于不同的群體，引物的多態信息含量指數差異較大。

表2云粳系列水稻品種SSR標記遺傳多樣性參數

Table2ThegeneticdiversityparametervaluesofSSRmarkersinjaponicaricevarietiesofYunjingseries

位點 染色體等位基因數基因多樣性指數多態信息含量(PIC)RM583160.280.27RM208240.420.38RM8277380.720.69RM471440.550.48RM274510.000.00RM190640.590.50RM336790.740.72RM72850.560.48RM278920.110.10RM2581030.110.11RM2241120.490.37RM191230.180.18RM1160.620.55RM423230.540.46RM85320.410.32RM551480.640.60RM267540.420.36RM253640.540.44RM432750.530.49RM331810.000.00RM219960.650.60RM3111020.060.06RM2091150.370.33RM171240.230.22RM1306790.670.64OSR28950.560.50RM297160.480.46RM2221040.460.40RM2541150.690.65RM71021230.470.40

2.2 鑒別云粳系列水稻品種的最佳引物組合

用 1 對 SSR 引物難以將全部云粳系列水稻品種分開，因此選取多態性信息含量較高的引物(RM8277、RM336、RM551 、RM219 、RM254、RM1)6對兩兩組合，分析其對云粳系列水稻品種的區分率。RM336和RM551引物組合分辨率最高，可以區分17個品種；其次是RM551 和RM1引物組合，可以區分 16個品種；再次是 RM336和RM219引物組合，可以區分 15個品種。根據 2 對引物組合的區分結果，繼續增加引物組合的數量。在增加到 5 對引物時，可將全部云粳系列水稻品種區分開來，5 對引物為 RM8277、RM336、RM551、RM254、RM1。用以上5對引物對供試的163個云南粳稻品種進行分析，該組引物能把云粳系列品種與其他粳稻品種區分開來。于是利用這 5 對引物構建云粳系列品種的分子身份證，既滿足唯一性和可識別(鑒別)性，又滿足了最簡引物組合的要求。

2.3 云粳系列水稻品種分子身份證編碼

利用可將全部供試云粳系列水稻品種區分的 5 對引物進行擴增，構建分子指紋圖譜，圖1為云粳39號在5個 SSR 位點的分子指紋圖譜。讀取 35份水稻品種的5個 SSR 熒光標記的指紋數據，按標記所在染色體由小到大排序，即按照RM1、RM8277、RM551、RM336、RM254的順序依次排列。例如，云粳39號的擴增產物在毛細管熒光電泳系統檢測得到的片段大小(bp)為82/84、215/215、171/193、154/154、142/142(水稻為二倍體, SSR 擴增只有 1 條主帶時，須重復記錄一次)。隨著條碼技術的發展，尤其是二維碼的出現，條碼可容納的數據量增加，因此直接用按順序排列的片段大小作為品種的分子指紋信息(表3)。 再加上水稻品種的基本商品信息, 包括作物種類、品種植物學類型、品種繁殖類型、品種名稱、生產經營者名稱、審定區域和審定的年份。最后利用二維碼技術將每份材料的按相同順序排列的字符串轉化成每份材料獨特的二維碼標識即分子身份證。例如：云粳39號的二維碼分子身份證見圖2，掃碼后內容如圖3。

圖1 云粳39號水稻的5個SSR分子標記指紋圖譜Fig.1 The SSR fingerprinting of rice Yunjing 39 at five SSR loci

3 討 論

3.1 分子身份證核心引物的選擇

分子身份證的構建既要滿足唯一性和可識別(鑒別)性，同時要滿足最簡引物組合的要求，以免造成構建的分子身份證冗余。引物檢測到的等位基因數、基因型數越多，PIC值越高，表明其區分品種的能力也越強，在分子身份證構建中具有的價值也越高[14]。SSR引物檢測到的等位基因數與所用材料的遺傳背景有關，對于不同遺傳背景的群體，引物的多態信息含量指數差異較大，即引物區分品種的能力差異較大。因此，本研究單獨對云粳系列水稻品種的指紋圖譜進行分析，篩選可以區分供試品種的最簡引物組合。篩選的 5 對核心引物組合可以把來自同一育種單位、遺傳背景較近的云粳系列水稻品種有效區分，而且能把云粳系列品種與云南省目前主要粳稻品種區別開來，說明用這5對引物構建云粳系列品種分子身份證既保證了身份證的唯一性，又達到了以最少標記區分品種的目的，減少了指紋分析的工作量，可作為快速鑒別水稻品種的一種有效方法。

表335個云粳系列水稻品種分子指紋信息

Table3Themolecularfingerprintinginformationof35japonicaricevarietiesofYunjingseries

編號品種名稱分子指紋(bp)1云粳9號82/82、196/196、191/191、141/141、169/1692云粳136號70/72、172/172、193/193、141/141、169/1693云粳1號82/84、196/196、193/193、141/141、171/1714云粳2號82/86、215/215、193/193、138/138、163/1635云粳3號79/82、212/212、193/193、157/160、171/1716云粳4號82/84、212/212、181/193、166/166、135/1357云粳5號82/84、215/215、191/191、151/154、135/1358云粳6號82/84、215/215、193/193、151/154、142/1429云粳7號82/84、215/215、193/193、138/141、163/16310云粳10號82/84、215/215、191/191、166/166、135/13511云粳12號82/84、212/212、193/193、166/166、135/13512云粳14號72/86、212/212、193/193、138/138、135/13513云粳15號82/84、212/212、193/193、163/166、135/13514云粳16號82/84、184/184、193/193、172/172、169/16915云粳17號82/84、212/212、193/193、163/166、163/16316云粳18號84/84、215/215、193/193、166/166、135/13517云粳19號84/84、190/212、193/193、166/166、135/13518云粳20號82/84、212/212、193/193、166/166、142/14219云粳21號84/84、212/212、193/193、166/166、135/13520云粳優1號84/86、199/199、191/191、141/141、142/14221云粳優5號82/84、199/199、191/191、163/166、142/14222云粳優8號82/84、212/212、195/195、166/166、142/14223云粳優9號82/84、212/212、195/195、163/166、142/14224云粳優10號84/84、212/212、191/191、166/166、135/13525云粳優15號82/84、212/212、193/193、163/166、142/14226云粳8號86/86、205/215、187/193、141/141、163/16327云粳25號84/84、212/212、187/191、166/166、142/14228云粳26號84/84、212/212、187/193、166/166、142/14229云粳29號82/82、215/215、187/191、154/154、135/13530云粳31號82/84、172/172、187/193、166/166、135/13531云粳32號82/84、212/212、187/193、138/138、135/13532云粳34號82/84、199/199、189/197、163/166、135/13533云粳36號79/82、190/205、189/197、166/166、135/13534云粳37號82/84、199/199、189/193、154/154、142/14235云粳39號82/84、215/215、171/193、154/154、142/142

圖2 云粳39號的二維碼分子身份證Fig.2 The molecular identity card of rice Yunjing 39

圖3 云粳39號的分子身份證內容Fig.3 The contents of the molecular identity card of rice Yunjing 39

3.2 分子身份證的編碼

目前構建分子身份證的編碼方法主要有 3 類[9]，都是以給基因位點擴增 DNA 條帶賦值為基礎，按一定順序進行編碼，串聯起來形成一組數據。不管研究者選擇哪種編碼方法，最終都要通過條碼技術將其轉換為可用機器識別的條碼或二維碼，才可利用掃描器進行掃描實現快速識別品種，擺脫人工讀取字符串式分子身份證的麻煩。隨著二維碼技術的發展，一個二維碼可容納的數據大幅增加，加之熒光測序技術在SSR技術中的應用，SSR 擴增產物通過熒光測序的檢測體系可以直接得出不同等位基因的片段大小[25-26]。本研究中直接用按序排列等位基因片段大小作為某一品種的分子身份標識，再加上該品種的基本商品信息，構成了此品種的分子身份證，使得使用者可直接獲得不同品種之間分子差異，也省去了在有新等位基因出現時重新對帶型編碼的麻煩。

3.3 分子身份證的用途

分子身份證與指紋圖譜的功能相同，但分子身份證原則上是以最少特異變異位點或標記為基礎，提取每份種質特異的遺傳信息，并通過數字化處理和軟件分析建立分辨不同種質的字符串形式，以達到簡單明了地區分品種間差異，在品種檢索時更直觀的目的[14]。本研究構建的品種分子身份證可以通過制作標簽，標識于商品種子包裝上，直接用于優良品種種子的防偽和溯源，使用者可用讀碼器獲得品種信息。分子身份證對水稻品種識別鑒定,品種標識,假冒偽劣品種鑒定,品種推廣等具有重要的意義和實際應用價值。