3D生物打印在組織工程中的應(yīng)用

左進富 孫淼 韓寧寧 劉方軍

【提要】 3D生物打印技術(shù)是一種以計算機三維模型為“圖紙”，裝配特制“生物墨水”，最終制造出人造器官和生物醫(yī)學產(chǎn)品的新科技手段。3D打印技術(shù)在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用近幾年獲得快速發(fā)展，具有良好的發(fā)展前景和巨大的社會價值，本文對其在組織工程及器官再造等方面的應(yīng)用進行綜述。

3D打印技術(shù)是上世紀80年代出現(xiàn)的一種快速成型技術(shù)，由計算機輔助設(shè)計（CAD）數(shù)據(jù)通過成型設(shè)備，以材料逐層堆積的方式實現(xiàn)三維實體成型[1-2]。普通打印機的打印材料是墨水和紙張，而3D打印機與傳統(tǒng)打印機最大的區(qū)別在于其使用的“墨水”是實實在在的原材料（金屬、陶瓷、細胞等），通過電腦控制可以把這些“打印材料”實現(xiàn)立體化而打印出3D實物模型。通俗地說，3D打印機是可以“打印”出真實的3D物體的一種設(shè)備。3D打印技術(shù)根據(jù)凝合成型技術(shù)的不同可分為光固化立體光刻、熔融沉積制造、選擇性激光燒結(jié)、疊片實體制造和3D噴印[3]。3D打印已在許多領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力和實用價值。

1 3D打印在心血管領(lǐng)域的應(yīng)用

1.1 心臟瓣膜

利用3D生物打印技術(shù)制備的可移植用心臟瓣膜，可克服傳統(tǒng)瓣膜移植術(shù)所存在的問題。3D生物打印具有以下的優(yōu)點：①根據(jù)造影或者心臟血管CT打印出的瓣膜更符合心臟的解剖結(jié)構(gòu)，減少或消除了因大小不匹配等問題帶來的困擾，制造出真正與患者相匹配的瓣膜；②取材患者自己的細胞，徹底杜絕免疫排異反應(yīng)的產(chǎn)生；③相比傳統(tǒng)瓣膜，可減少抗凝藥物的服用周期[4]。有研究通過經(jīng)食管心臟超聲獲取人二尖瓣的動態(tài)影像學數(shù)據(jù)，再使用立體光刻3D打印技術(shù)，分別構(gòu)造出了二尖瓣在收縮期和舒張期的實體模型，全過程僅僅用了30 min。該研究通過模擬組織結(jié)構(gòu)、大小、體積的3D圖像重建及模擬定量可視化打印，使得3D生物打印自體組織移植物成為可能[4]。Lueders等[5]利用水凝膠和臍帶血干細胞打印出了具有良好生物功能特性的心臟瓣膜。

1.2 血管

既往人造血管因無法產(chǎn)生內(nèi)皮細胞而存在以下缺點：①人造血管體內(nèi)移植后易發(fā)生堵塞、凝血等問題；②移植傳統(tǒng)人工血管的患者需終身服用抗凝藥；③傳統(tǒng)人工血管的使用壽命短，僅10年左右。利用3D生物打印技術(shù)打印出來的生物血管因能夠生成血管內(nèi)皮細胞層而有利于血液流動，患者術(shù)后服用抗凝劑的時間也可縮短到5 d左右，此后無需任何藥物治療，而且3D打印血管可終身使用。

3D生物打印血管技術(shù)利用提取的生物自體間充質(zhì)干細胞制備成生物墨汁，應(yīng)用于3D打印設(shè)備，構(gòu)建出具有生物活性的人工血管。將其置換到生物體內(nèi)后，3D血管通過再生分化與正常血管融合，且功能和結(jié)構(gòu)保持一致，術(shù)后血管的各項生物檢測指標在一定時間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)任何異常。有研究提取恒河猴的ADSC進行體外培養(yǎng)擴增，隨后用獨創(chuàng)的“生物磚”技術(shù)將ADSC轉(zhuǎn)化成生物“墨汁”用于3D生物血管打印而構(gòu)建出了人造血管，植入實驗動物自體體內(nèi)后，人造血管成功存活并再生形成了具備一定功能的血管組織。

2 3D打印在骨組織工程中的應(yīng)用

目前，臨床修復骨缺損的骨組織移植材料有自體骨、同種異體骨和人工骨，其中自體骨來源有限及供體部位的二次傷害是臨床應(yīng)用中的最大弊端；同種異體骨存在材料來源限制及潛在疾病感染等問題；人工骨存在無法專屬定制、加工周期長、結(jié)構(gòu)尺寸難與患者骨損壞部位匹配，以及免疫排斥等缺點[6]。骨組織工程的出現(xiàn)為解決這一難題提供了新思路。骨組織工程的研究包括多孔生物材料支架、成骨種子細胞和促骨生長因子三個要素。成骨細胞在骨組織工程支架材料上的黏附、增殖、分化直接關(guān)系到骨損傷修復的成敗[7-8]。骨組織工程生物支架材料應(yīng)具有三維多孔的超微結(jié)構(gòu)且支架內(nèi)部孔隙間交融貫通，其適合的孔隙率、良好的生物相容性及足夠的比表面積可在一定程度上保證黏著的種子細胞的密度、細胞營養(yǎng)液的輸送和代謝產(chǎn)物的排放，有利于促進成骨細胞的增殖、分化以及在三維多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)的均勻擴散附著[9-10]。

3D生物打印技術(shù)利用骨缺損病變部位的CT/MRI成像數(shù)據(jù)用于計算機三維設(shè)計，并精確制作個性化的3D生物材料支架，實現(xiàn)了生物支架與骨缺失病變部位的完美匹配，并可有效模擬正常骨組織的微觀結(jié)構(gòu)。3D生物打印在組織工程支架材料的微觀和宏觀結(jié)構(gòu)構(gòu)建方面具備前所未有的精確性，同時3D打印技術(shù)制備的骨組織工程支架在機械強度、孔隙調(diào)節(jié)、空間結(jié)構(gòu)復雜性等方面均具有獨特的優(yōu)勢[11-12]。Tay等[13]使用微粒過濾法過濾后的聚己內(nèi)酯和聚乙烯醇混合粉末為生物墨水材料進行3D生物打印，制備的骨組織工程支架具有足夠的韌性，孔隙率較高，連通性能好，基本滿足了骨組織工程支架的三維多孔要求。賴毓霄等[14]利用低溫3D打印技術(shù)，將鎂有機復合入聚乙交酯-丙交酯共聚物（PLGA）、β-磷酸三鈣（TCP）多孔支架中，設(shè)計制造了具有生物活性的可降解PLGA/TCP/Mg多孔支架，并對該材料的三維結(jié)構(gòu)、力學性能及體內(nèi)外生物活性進行了研究。實驗數(shù)據(jù)證明，利用新型低溫3D打印技術(shù)制備的PLGA/TCP/Mg多孔支架具有良好的相互連接的多孔結(jié)構(gòu)及適宜骨重建的機械強度。體內(nèi)外實驗也表明PLGA/TCP/Mg支架具有良好的生物相容性和生物活性，有利于植入部位成骨發(fā)生及血管組織的長入。張海峰等[15]采用3D打印技術(shù)打印出了聚乳酸－羥基磷灰石復合支架并復合骨髓基質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)，結(jié)果表明骨髓基質(zhì)干細胞能夠在復合材料上有效黏附生長，3D打印聚乳酸－羥基磷灰石復合材料具有良好的細胞相容性，可作為骨組織工程的支架材料。

3 3D打印在軟骨組織工程中的應(yīng)用

上世紀90年代，曹誼林在裸鼠體內(nèi)成功構(gòu)建人耳郭形態(tài)軟骨，為臨床軟骨缺損的修復提供了極具前景的新思路。但是，傳統(tǒng)組織工程研究仍存在一些技術(shù)上的難點，特別是生物支架材料超微結(jié)構(gòu)的三維構(gòu)建將直接影響到種子細胞的有效黏附、均勻分布及其增殖分化，最終影響到軟骨組織的再生及修復缺損的效果。

近幾年，3D生物打印被逐漸引入到組織工程研究領(lǐng)域中。研究表明，通過3D生物打印技術(shù)制備出來的組織顯示出良好的再生能力[16]。3D生物打印技術(shù)與干細胞的整合在組織工程領(lǐng)域表現(xiàn)出了巨大的潛力。利用3D生物打印技術(shù)打印出來的組織工程支架具備復雜的內(nèi)部三維多孔結(jié)構(gòu)，能夠滿足細胞的黏附與增殖，更重要的是，支架外形可以與缺損組織的解剖結(jié)構(gòu)相匹配[17]。利用3D打印技術(shù)，可于時間和空間上精確、按需沉積不同種類的生物材料（包括細胞、具有生物相容性且可降解的水凝膠、生長因子等），在制造任意復雜形狀支架的同時，可有效制定支架的孔隙率、孔徑大小等尺寸參數(shù)，促進細胞增殖和組織再生，從而解決傳統(tǒng)軟骨組織工程存在的不足[18]。

袁清獻等[19]以絲素蛋白和Ⅱ型膠原為支架材料打印網(wǎng)格狀的3D支架模型，力學性能試驗測得支架彈性模量具有率相關(guān)性，在支架接種軟骨細胞后，細胞能夠在支架上黏附增殖，這表明3D打印的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)的絲素蛋白-Ⅱ型膠原支架是適合軟骨細胞生長的，滿足組織工程中骨關(guān)節(jié)的軟骨修復要求。Cathal等[20]以 GelMa/HAMa作為基底材料，加入脂肪干細胞后，用生物打印筆裝置在軟骨損傷部位進行原位打印，并通過UV光源照射固化。實驗結(jié)果表明，經(jīng)3D打印成型的干細胞具有較高的存活率，并有利于軟骨損傷的愈合修復。徐奕昊等[21]取20例人鼻中隔軟骨，經(jīng)分離、培養(yǎng)、擴增后，接種于依照3D打印技術(shù)制備出的鼻翼軟骨PGA/PLA支架上，植入裸鼠皮下培養(yǎng)8周，構(gòu)建的組織工程化軟骨在形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)上與人軟骨無明顯差異。

4 3D打印技術(shù)在器官再造中的應(yīng)用

目前，等待器官移植的患者呈逐年遞增的趨勢，但供體供不應(yīng)求，同時異體器官移植后需長期服用免疫抑制劑，患者的生活質(zhì)量受到嚴重影響。據(jù)報道，中國每年因末期器官衰竭而需要器官移植的人大約有150萬，但實際只有不到1萬的器官可供移植，供求比例達到1∶150[22]。而人體器官3D打印技術(shù)的發(fā)展可能會為這些患者提供一線希望。Charles Hull于1986年開發(fā)出了第一臺3D印刷機，2005年首個高清晰彩色3D打印機亦研制成功，隨著3D打印技術(shù)的迅猛發(fā)展，現(xiàn)如今人體器官的3D打印亦成為可能。3D生物打印是3D打印技術(shù)在醫(yī)學領(lǐng)域最高層次的應(yīng)用，首先以生物降解材料為“油墨”搭建細胞生長繁殖所需的微環(huán)境和三維空間構(gòu)架，將自身成體干細胞和包含細胞分化因子在內(nèi)的生物材料混合后作為具有活性成分的 “生物油墨”，3D打印出具有生物活性的人造組織器官[23]。活體組織與器官打印的原材料包括活體細胞材料和可用作細胞生長支架的水凝膠，由于3D生物打印的種子細胞來源于患者自身，不僅有效免除了異體組織器官移植存在的免疫排斥反應(yīng)，還有效解決了器官供不應(yīng)求的問題，促進了人造組織器官的發(fā)展。

2013年，有研究在人耳解剖結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，利用3D打印細胞接種的水凝膠基質(zhì)，以及銀納米顆粒組成的交織導電聚合物生成了一個仿生耳。打印出來的耳朵表現(xiàn)出增強的射頻接收聽覺感應(yīng)，并且互補的左耳和右耳可以收聽立體聲音頻[24]。國際空間站上的3D生物打印機，在零重力下3D打印出了實驗鼠的甲狀腺。在零重力環(huán)境下，3D打印出來的器官和組織比在地球上要成熟得更快，因此效率更高。該項新研究可能為未來在國際空間站3D打印人體器官鋪平道路[25]。2017年，Kizawa等[26]采用3D打印技術(shù)成功制造出迷你版的具有生物活性的人類肝臟組織，能代謝藥物、葡萄糖以及脂質(zhì)，分泌膽酸，其功能可以維持數(shù)周。

人體器官3D打印技術(shù)相對傳統(tǒng)的醫(yī)療手段表現(xiàn)出獨特的價值，既可解決供體器官供不應(yīng)求的問題，又可有效避免異體免疫排斥反應(yīng)。隨著3D生物打印的發(fā)展，有望使器官移植在不遠的將來取得突飛猛進的進展。

5 展望

3D打印正在多個垂直行業(yè)顛覆制造過程，尤其是在醫(yī)療領(lǐng)域，導致了更多創(chuàng)新、高效的產(chǎn)品出現(xiàn)。全球3D打印醫(yī)療垂直應(yīng)用市場，預測從2013年至2019年的年復合增長率將達到15.4%。

3D打印技術(shù)正處在蓬勃興起的階段，大大擴展了一些疾病的治療前景，改變了傳統(tǒng)組織工程的部分理念。3D打印給人類生物醫(yī)學提供了無限的應(yīng)用可能和想像空間。隨著材料學和計算機技術(shù)的不斷發(fā)展，以及再生醫(yī)學、組織工程和分子生物學領(lǐng)域研究的深入，3D生物打印技術(shù)可為組織修復和器官移植帶來更加光明的前景。