人血漿中雷貝拉唑與氯吡格雷測(cè)定方法及存在的問題

倪一帆

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310000）

1.國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

氯吡格雷是一種噻吩并吡啶類衍生物，其作用機(jī)制是可以抑制二磷酸腺苷（ADP）與血小板受體P2Y12結(jié)合，使纖維蛋白原無法與糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合[1]，實(shí)現(xiàn)抗血小板聚集作用及抗血小板形成的作用。現(xiàn)在應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化患者的預(yù)防腦卒中、心肌梗死等急性缺血事件的發(fā)生。通常氯吡格雷和阿司匹林的聯(lián)合使用，比在急性冠脈綜合征患者單獨(dú)使用阿司匹林有顯著減少死亡率、非致命性心梗死、中風(fēng)等的風(fēng)險(xiǎn)。

氯吡格雷和阿司匹林的治療降低了急性冠脈綜合征的復(fù)發(fā)率，但是經(jīng)常引起消化道的出血、消化不良等不良反應(yīng)。為了減少不良反應(yīng)，質(zhì)子泵抑制劑（雷貝拉唑）被應(yīng)用在氯吡格雷和阿司匹林的治療中，來減少消化道出血的風(fēng)險(xiǎn)。雷貝拉唑是一種抑制分泌的藥物，無抗膽堿和抗H兩組胺特性，可以在胃壁細(xì)胞表面通過抑制H+/K+-ATP酶活性[1]，阻斷胃酸分泌的最后環(huán)節(jié),抑制胃酸的分泌，從而產(chǎn)生抑制氯吡格雷的不良反應(yīng)。

但是，一些報(bào)道中提到氯吡格雷和雷貝拉唑可能在人體內(nèi)發(fā)生互相作用，而使氯吡格雷的抗血小板聚集作用降低。

為了證明這一現(xiàn)象，研究者們研究了氯吡格雷在體內(nèi)代謝的過程。氯吡格雷是一種前藥，它被吸收到體內(nèi)后有85%通過水解酯酶水解生成沒有活性的羧酸鹽衍生物，還有一小部分母體化合物通過肝臟生物轉(zhuǎn)換的氧化作用后形成2-氧基-氯吡格雷，主要由細(xì)胞色素P450同功酶2B6和3A4調(diào)節(jié)。再經(jīng)過水解反應(yīng)形成活性代謝物，一種硫醇衍生物。而雷貝拉唑也可以通過肝藥酶途徑代謝，通過競(jìng)爭(zhēng)抑制CYP2C19和CYP3A4同工酶來降低氯吡格雷的臨床作用[5-6]。

從臨床回顧性研究中來看，氯吡格雷和雷貝拉唑有互相作用。現(xiàn)有的臨床回顧性研究尚存在一定的局限性：（1）和對(duì)照組相比,使用雷貝拉唑的患者往往有更多并發(fā)癥,比如腎功能不全,糖尿病等,這些因素可能使血小板的聚集程度加劇,也是影響氯吡格雷發(fā)揮治療效果的主要因素；（2）其他一些影響心血管疾病轉(zhuǎn)歸的因素,如吸煙、非處方類PPI 的使用情況等并未在現(xiàn)有的研究中列出[3]。

目前尚缺少兩者相互作用的直接證據(jù)，即藥代動(dòng)力學(xué)相互作用研究。

2.測(cè)定方法

為了可以更好的觀察氯吡格雷和雷貝拉唑有的互相作用是否存在，需要開展氯吡格雷和雷貝拉唑相互作用的人體藥代動(dòng)力學(xué)研究。人體血漿中氯吡格雷及代謝產(chǎn)物或單獨(dú)測(cè)定雷貝拉唑方法均已有文獻(xiàn)報(bào)道：

2.1 氯吡格雷及其代謝產(chǎn)物在血漿中含量的測(cè)定方法

2.1.1 氯吡格雷在人血漿濃度的液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定法[7-9]

由劉淼[9]，等研究者發(fā)表在中國臨床藥理學(xué)雜志，液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定法測(cè)定人血漿中的氯吡格雷濃度。該法血漿預(yù)處理用0.5ml血漿，使用叔丁基甲醚進(jìn)行液-液提取。流動(dòng)相為乙腈-水（含有10mmol/L的醋酸銨，調(diào)節(jié)pH為4.0）（70:30）。使用正離子檢測(cè)，掃描方式是多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，測(cè)定化合物的母離子和子離子。靈敏度為10pg/ml。

結(jié)果為氯吡格雷的線性范圍為10～12000pg/ml，最低定量濃度為10pg/ml。

本方法優(yōu)點(diǎn)：使用液質(zhì)聯(lián)用方法，可以增加檢測(cè)的靈敏度；使用叔丁基甲醚液液提取方法，提取效果好、操作簡(jiǎn)單減少了誤差和雜質(zhì)的影響；流動(dòng)相選擇乙腈-水體系使出峰時(shí)間提前。可適用于血藥濃度監(jiān)測(cè)、群體藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)和臨床個(gè)體化給藥的研究。

2.1.2 RP-HPLC法測(cè)定人血清中氯吡格雷濃度的方法

由王夏芹[10]，等研究者在安徽醫(yī)藥期刊上發(fā)表，使用反相高效液相色潽法測(cè)定人血清中氯吡格雷的含量。樣品預(yù)處理方法是取0.5ml血清，分別使用二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯：二氯甲烷(80：20)液-液提取法。使用流動(dòng)相為磷酸二氫鉀溶液-甲醇（使用磷酸調(diào)pH至3）（35:65）。使用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長為235nm。

結(jié)果為氯吡格雷的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.625～4.0mg/L,最低定量濃度為0.0625mg/L，取對(duì)照品溶液經(jīng)水稀釋后，按信噪比大于5的要求，結(jié)果本品最低檢測(cè)限為0.00313mg/L。提取回收率、方法回收率、日內(nèi)日間RSD、準(zhǔn)確度等標(biāo)準(zhǔn)符合SFDA的相關(guān)要求。

使用流動(dòng)相磷酸二氫鉀溶液-甲醇為35:65，可以是氯吡格雷的保留時(shí)間在14.5min左右，基本能滿足臨床上快速測(cè)定人血清中氯吡格雷濃度的要求。使用二氯甲烷提取效果比使用乙酸乙酯和乙酸乙酯：二氯甲烷(80:20)提取效果好，縮短了提取時(shí)間，減少了人工和延長了色譜柱的使用壽命。為檢測(cè)氯吡格雷的血藥濃度提供了簡(jiǎn)單可行的方法，還可用于氯吡格雷藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究。

2.1.3 LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中氯吡格雷及其羧酸代謝物的濃度[11-12]

由樊宏偉[12]，等研究者發(fā)表在中國新藥與臨床雜志中。該方法可以同時(shí)測(cè)定血漿中氯吡格雷和其羧酸代謝物的濃度。血漿預(yù)處理的方法是取0.5ml血漿，使用乙醚：正己烷=4：1（v：v）2次液-液提取法（中性和酸化條件下），采用那格列酮和吡格列酮這兩種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。其流動(dòng)相是甲醇-0.1%甲酸（80：20）。以多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)方式監(jiān)測(cè)母離子和子離子。

結(jié)果為氯吡格雷的線性范圍為5～5000ng/L，最低定量限為5ng/L；SR26334的線性范圍為20～2500ug/L，最低定量限為20ug/L。

優(yōu)點(diǎn)在于使用檢測(cè)方法為串聯(lián)質(zhì)譜，最低檢測(cè)限可以達(dá)到1ug/L以下，靈敏度高。使用乙醚：正己烷=4：1（v：v）2次液-液提取法可以提高氯吡格雷和SR26334的回收率。兩種內(nèi)標(biāo)在實(shí)際使用中可以選擇一種。該方法可用于氯吡格雷的新藥臨床研究,也可用于ACS病人及其他需長期治療的病人氯吡格雷及SR26334血藥濃度的常規(guī)的監(jiān)測(cè)。

2.2 雷貝拉唑含量在血漿中的測(cè)定

2.2.1 HPLC-MS法測(cè)定人血漿中雷貝拉唑的濃度及其藥動(dòng)學(xué) 由王曉輝[13]等研究者在中國臨床藥學(xué)雜志上發(fā)表，建立人血漿中雷貝拉唑的HPLC-MS測(cè)定方法。血漿樣品預(yù)處理，取血漿500ul，使用乙酸乙酯進(jìn)行液-液提取。流動(dòng)相使用乙腈-水（75：25）。使用質(zhì)譜檢測(cè)，采用正離子方式檢測(cè)。

結(jié)果為雷貝拉唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為20～1000ug/L，最低定量濃度為20ug/L。

實(shí)驗(yàn)所用的方法優(yōu)點(diǎn)為專屬性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速、重現(xiàn)性好、靈敏度高，適用于雷貝拉唑鈉腸溶片的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和生物等效性研究，為雷貝拉唑的臨床藥動(dòng)學(xué)研究提供了一種新的分析方法。

2.2.2 高效液相色譜法測(cè)定血漿中雷貝拉唑的濃度 由扈本荃[14]，等研究者在中國藥學(xué)雜志上發(fā)表，建立高效液相色譜法測(cè)定血漿中雷貝拉唑的濃度。取血漿1.0ml，使用醋酸乙酯進(jìn)行液-液提取。流動(dòng)相：0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（用0.1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7）一乙腈(69:31)。使用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長為284nm。

結(jié)果為雷貝拉唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為5.46～2184.61ug/L，最低定量濃度為5.46ug/L。

流動(dòng)相中使用緩沖鹽，可以使用出峰時(shí)間更為理想并且無血漿雜質(zhì)峰的干擾。但是缺點(diǎn)是使用鹽濃度過高，會(huì)影響柱子的壽命，而每次沖洗柱子時(shí)要花費(fèi)更多的時(shí)間。而緩沖液的濃度會(huì)影響實(shí)驗(yàn)方法的提取率。本法準(zhǔn)確、靈敏，適于雷貝拉唑藥動(dòng)學(xué)研究。

3.存在問題

目前報(bào)道的方法中，大都為氯吡格雷的測(cè)定或者氯吡格雷以及其無活性羧酸代謝物的測(cè)定方法，對(duì)于氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物硫醇衍生物的報(bào)道很少見。氯吡格雷的硫醇衍生物是觀察兩者相互作用比較理想的指標(biāo)，但是氯吡格雷的硫醇衍生物在血漿中可能不穩(wěn)定而氯吡格雷硫醇衍生物又是氯吡格雷相互作用的關(guān)鍵指標(biāo)。此外，由于氯吡格雷和雷貝拉唑相互作用研究需要同時(shí)測(cè)定多種成分（包括氯吡格雷、代謝產(chǎn)物、雷貝拉唑），目前尚無方法可以同時(shí)測(cè)定，亟需建立一個(gè)同時(shí)測(cè)定氯吡格雷、氯吡格雷代謝產(chǎn)物和雷貝拉唑的方法，為氯吡格雷的相互作用研究提供支持。