面向生物打印的組織工程支架材料選配

武力，亓春偉，陳勇，李欣芯，馮銘龍，許龍賀

(大連交通大學 機械工程學院，遼寧 大連 116028)*

0 引言

三維打印技術(shù)(3D Printing)即快速成型技術(shù)，它以數(shù)字模型文件為基礎(chǔ)，運用金屬、陶瓷或高分子等材料，通過逐層打印的方式來構(gòu)造結(jié)構(gòu)體[1].目前，3D打印技術(shù)在醫(yī)療上的應(yīng)用逐漸廣泛，涉及到醫(yī)學模型[2]、手術(shù)導板[3]、個性化化植入物[4]、生物組織支架[5]、體外細胞結(jié)構(gòu)體[6]等等.組織工程是運用工程科學與生命科學的基本原理和技術(shù)，研究與開發(fā)生物替代物 ,從而恢復、維持和改進人體組織功能的一門新興交叉學科[7].運用三維生物打印技術(shù)打印人體組織結(jié)構(gòu)，構(gòu)建體外細胞生長環(huán)境，對于藥物研發(fā)、組織再生和器官移植具有積極推動作用.Tina Qing Huang等采用PEGDA/LAP/HMBS的混合材料通過3D打印技術(shù)制造仿生微觀結(jié)構(gòu)用于癌細胞移植[8].Falguni Pati等采用PCL材料，通過熔融沉積打印技術(shù)打印出細胞加載的支架結(jié)構(gòu)[9].M. Enamul Hoque等采用PCL/PEG材料打印出組織細胞三維支架[10]. 本文以體外構(gòu)建組織工程支架為目標，基于生物3D打印機，從選擇材料開始，以析因試驗為基礎(chǔ)，選擇出材料配比，為后期打印多孔支架，培養(yǎng)體外細胞結(jié)構(gòu)體，進行個性化測試奠定基礎(chǔ).

1 生物打印機與打印

在選擇材料配比的過程中，以德國envision TEC公司開發(fā)的3D-Biopiotter生物打印機的點膠針筒擠出材料長度作為評價材料配比的依據(jù).其工作原理是通過擠壓針頭在三個維度上的移動，將處于流體、熔融、膠體和糊狀的材料以連續(xù)線條或者單點方式沉積形成三維結(jié)構(gòu)體.打印的材料涉及金屬、陶瓷、高分子等，單一材料、混合材料或多種材料均可單獨或者同時利用生物打印機進行打印，但必須制成能動性的流體.

生物材料(Biomaterials)是近年來快速發(fā)展的新興學科，是材料學、生命科學、醫(yī)學、工程學的交叉融合，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學、新型制造、生物技術(shù)等領(lǐng)域[11].狹義上的生物材料是指生物醫(yī)用材料(Biomedical Materials)，是一類用于診斷、治療、修復或替換人體組織、器官或增進其功能的新型高技術(shù)材料.生物醫(yī)用材料按材料的組成和性質(zhì)可以分類如下：金屬材料、生物陶瓷和高分子材料.對于金屬和生物陶瓷材料，雖具有生物相容性，但是不具有生物降解性，因此不能作為組織工程支架的選材，而高分子材料同時具備生物相容性與生物降解性，所以從高分子材料中選擇支架材料.通過篩選確定天然高分子材料明膠與海藻酸鈉作為打印材料.明膠與海藻酸鈉的相關(guān)特性介紹，見表1.

表1 明膠與海藻酸鈉的特性

2 實驗設(shè)計

2.1 設(shè)計試驗

析因設(shè)計又稱全因子實驗設(shè)計，是將實驗中涉及的全部實驗因素的各水平全面組合形成不同的實驗條件，每個實驗條件進行兩次或兩次以上的獨立重復實驗[12].本試驗涉及四個因素：明膠和海藻酸鈉的用量、溫度、壓力，各因素有不同的水平，將全部因素的各水平組合成不同的試驗進行，測量每一個試驗下的擠出長度，現(xiàn)將各因素與各水平介紹如下，見表2.

表2 因素與水平明細

2.2 材料配制

明膠和海藻酸鈉選用成都艾科，AR.配制過程如下：

(1)首先用電子稱稱量一定質(zhì)量的明膠與海藻酸鈉，然后用量筒量取一定量的去離子水，倒入燒杯中，用玻璃皿蓋在燒杯口；

(2)用磁力加熱攪拌器加熱到一定溫度，將明膠加入燒杯，停止加熱，同時用磁力攪拌器開始攪拌，直至明膠全部溶解且形成均一溶液；

(3)最后加入海藻酸鈉，一邊加熱一邊攪拌，當溫度升至一定溫度后，停止加熱，但是繼續(xù)攪拌.

(4)隔一段時間加熱一次，升至一定溫度，如此反復幾次，至最終配成均一混合溶液；

在析因試驗中，不同配比的材料采用相同配置條件，避免配置溶液的各因素對后續(xù)試驗造成影響，將配置成功的混合水溶液裝入點膠管內(nèi)，為進一步試驗做準備.為了方便記錄試驗數(shù)據(jù)，對不同配比下的混合溶液進行編號，從下至上，從左到右，依次編號為1、2、3、……、16，如圖1.

圖1 不同濃度配比下的編號

2.3 數(shù)據(jù)收集

將配置成功的均一混合水溶液裝入點膠針筒內(nèi)，加裝塞子，并排除針筒內(nèi)的空氣，旋擰上針頭，加載在生物打印機的打印倉內(nèi)，調(diào)節(jié)打印機的相關(guān)參數(shù)以及進行相關(guān)設(shè)置，為收集數(shù)據(jù)做準備.因為隨著溫度的降低，混合水溶液發(fā)生脫水與交聯(lián)現(xiàn)象，所以對于同一配比濃度下的混合水溶液，將溫度從30～25～20～15℃進行調(diào)節(jié)，進行相關(guān)試驗.將同一溫度下的混合水溶液，調(diào)節(jié)壓力從40～80～120～160～200 kPa變化.將同一配比濃度下的混合水溶液，在一定時間內(nèi)、不同溫度、不同壓力下的擠出長度記錄在表格中.現(xiàn)將數(shù)據(jù)收集過程中出現(xiàn)的相關(guān)問題予以說明，在30℃保溫的過程中，不同配比濃度的混合水溶液均在針頭形成懸滴，則說明30℃混合溶液流動性較高，而且在30℃時，無法形成均勻的懸掛在針頭上的一根線條，兩個懸滴展示如圖2.在25℃時，材料能夠形成均勻的線條， 在20℃時， 有輕微彎曲現(xiàn)象，在15℃時，彎曲較重且毛刺現(xiàn)象明顯，現(xiàn)將10g明膠與1.5 g海藻酸鈉混合溶液， 不同溫度的出絲展現(xiàn)出來，如圖3.通過對不同溫度下線條的變化可知，說明隨著溫度的降低，材料表現(xiàn)出不同特性.

(a)

(b)

(a) 25℃線條

(b) 20℃線條

(c) 15℃線條

2.4 數(shù)據(jù)處理與試驗結(jié)果

對收集到的在不同濃度配比下，不同溫度，不同壓力下的擠出長度的數(shù)據(jù)進行處理，將所有數(shù)據(jù)分成四個不同溫度下進行處理，以橫軸為不同配比濃度，縱軸為擠出長度，繪制得到在不同溫度下，不同壓力條件下，不同配比濃度下的擠出長度，在30℃條件下，如圖4所示，在25℃條件下，如圖5所示，在20℃條件下，如圖6所示，在15℃條件下，如圖7所示.

從圖4中可知，在30℃時，在不同濃度的混合水溶液中，即使在最小壓力40 kPa的情況下，擠出長度最短為20 mm，擠出長度在實際打印中作為擠出速度的參考，對于擠出長度為20 mm來說，相應(yīng)的擠出速度過大，則在30℃時，即使采用較小的壓力，所有濃度溶液均無法進行打印操作.

圖4 30℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長度

從圖5中可知，在Ⅰ區(qū)，擠出長度較大，在Ⅱ區(qū)中，壓力為40 kPa的時候，基本上擠不出，而隨著壓力的增大，擠出長度劇增，在Ⅲ區(qū)，材料擠出長度相對趨于穩(wěn)定，呈逐漸減小的趨勢，而在Ⅳ區(qū)，擠出長度趨于零，從不同區(qū)擠出長度的變化可知，在Ⅲ區(qū)，則比較適合打印.

圖5 25℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長度

從圖6中可知，在Ⅱ區(qū)，相對于圖5中的Ⅱ區(qū)，材料擠出長度明顯減小，說明混合水溶液的穩(wěn)定性較差，在Ⅲ區(qū)中，除編號9材料擠出長度發(fā)生波動變化較大之外，其他配比濃度下則相對穩(wěn)定，且擠出長度逐漸減小.

圖6 20℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長度

從圖7中可知，在15℃時，在不同濃度的混合溶液中，當溶液粘稠度較低時，擠出長度較大，而其他情況下，擠出長度基本上為零，即無法擠出材料，則實際打印過程中無法進行打印，材料穩(wěn)定性較差，通過查閱資料可知由于溫度較低，混合水溶液會發(fā)生脫水與物理交聯(lián)現(xiàn)象，因此，在15℃的條件下，并不是理想的打印溫度.

圖7 15℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長度

由圖4～圖7可知以下結(jié)果：

(1)Ⅰ、Ⅱ 、Ⅲ、Ⅳ區(qū)在相同壓力與溫度的條件下，隨著海藻酸鈉濃度的增加，擠出長度成變短趨勢，即隨著海藻酸鈉濃度的增加，溶液粘稠度增加.

(2)編號從1-5-9-13，2-6-10-14，3-7-11-15，4-8-14-16變化時，在相同壓力與溫度條件下，隨著明膠濃度的增加，擠出長度成變短趨勢，即隨著明膠濃度的增加，溶液粘稠度增加.

(3)編號從1-6-11-16變化時，可知在相同溫度與壓力條件下，隨著同時增加明膠與海藻酸鈉配比濃度，擠出長度變短的趨勢.

(4)在相同濃度與溫度的條件下，隨著壓力的增加，擠出長度呈現(xiàn)增長趨勢；在相同濃度與壓力的條件下，隨著溫度的降低，擠出長度呈現(xiàn)縮短趨勢；在相同壓力與溫度的條件下，隨著濃度的增加，擠出長度呈現(xiàn)縮短趨勢.

從(1)(2)結(jié)果分析可知，擠出長度隨著一種材料濃度發(fā)生變化的情況，從(3)可知，擠出長度隨著兩種材料濃度同時增加的變化情況.從(4)可知，在不同濃度、壓力和溫度的相互關(guān)系中，擠出長度變化趨勢，從圖4、圖7可知，在30℃和15℃條件下，擠出長度的變化趨勢，同時根據(jù)擠出長度的趨勢知在30℃和15℃的條件下，不可進行相關(guān)打印試驗.從圖5、圖6可知，在Ⅰ區(qū)中，擠出長度太長，無法進行打印，在Ⅳ區(qū)內(nèi)，擠出長度幾乎全部為零，也無法進行打印，在Ⅱ區(qū)，材料穩(wěn)定性較差，擠出長度波動性較大，在Ⅲ區(qū)中，除編號9材料擠出長度發(fā)生波動變化較大之外，其他配比濃度下則相對穩(wěn)定，逐漸趨于零，通過以上分析可知，則選擇在25℃下，編號10作為打印最佳配比較好，依據(jù)相關(guān)壓力，進一步進行相關(guān)參數(shù)優(yōu)化，為打印相關(guān)結(jié)構(gòu)體，進行細胞培養(yǎng)以及個性化檢測奠定基礎(chǔ).

3 結(jié)論

采用明膠與褐藻酸鈉作為生物打印材料，運用析因試驗法進行了材料擠出性能試驗，測量了16種不同配比溶液分別在15、20、25、30℃溫度和40、80、120、160、200 kPa壓強下的生物打印機點膠針頭擠出長度，繪制了15℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長度、20℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長度、25℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長度、30℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長度的四條曲線，以擠出材料性態(tài)和擠出長度為評價指標，分析得出在25℃，壓力200 kPa的條件下，15 g明膠與1 g海藻酸鈉配制的混合溶液的擠出長度適合打印，為進一步優(yōu)化打印參數(shù)與打印相關(guān)結(jié)構(gòu)體，進行細胞培養(yǎng)以及個性化檢測奠定基礎(chǔ).