葡萄糖氧化酶基因在解脂耶氏酵母中的表達及發酵優化

劉曉筱 ， 張 娟 *， 陳 堅 ， 堵國成

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

葡 萄 糖 氧 化 酶 （β -D-glucose：oxygen 1-oxidoreductase；EC 1.1.2.3.4，GOD）是一種黃素糖蛋白[1]，其催化反應專一性較強，對β-D-葡萄糖有高度的專一性。葡萄糖氧化酶分子為二聚體，含有兩個亞基，相對分子質量約為130 000~170 000[2]，每個亞基可結合一個FAD分子，因此每個酶分子有兩個FAD結合位點。GOD是一種需氧脫氫酶，以氧為電子受體，能專一地將β-D葡萄糖氧化為葡萄糖酸，氧被還原生成過氧化氫（H2O2）[3]。從GOD催化葡萄糖氧化反應的機理可以看出，輔酶FAD從β-D葡萄糖奪走兩個H原子形成還原態輔酶FADH2[4]，同時β-D葡萄糖被氧化生成δ-葡萄糖酸內酯，隨后δ-葡萄糖酸內酯水解生成δ-葡萄糖酸，還原態的GOD被氧化成氧化態的GOD并生成H2O2[5-6]，見圖1。

圖1 GOD催化反應β-D葡萄糖機理示意圖Fig.1 Catalytic reactions of β-D glucose mediated by GOD

葡萄糖氧化酶是酶技術領域中最主要的工具酶之一，因其可以與氧和葡萄糖發生催化反應，而被廣泛應用于食品[7-9]、飼料、醫藥等眾多相關領域[10-11]，在面制品、啤酒生產、牛奶生產以及食品除氮抗氧化等領域有著極其重要的作用和巨大的市場需求[12]。

葡萄糖氧化酶的工業大規模發酵生產主要采用黑曲霉[13]和青霉菌株[14]，但黑曲霉和青霉在發酵過程中產生的大量雜蛋白質對后期的分離純化工作造成很大的困難，且大大增加了生產成本。在傳統技術領域，葡萄糖氧化酶的生產菌株一直通過物理方法如紫外線、γ射線和化學方法如亞硝基胍等誘變方法進行篩選。2000年以后，通過基因工程和分子生物學技術，不同來源的GOD基因已成功在同源、異源宿主細胞中得到克隆、測序和表達[15-16]。然而，這些重組菌在生產過程中抗生素或誘導劑的添加，給GOD在食品領域的應用帶來了安全隱患。總體而言，已構建重組菌生產的GOD尚不能滿足食品加工領域對安全性的要求。因此，構建食品級的表達體系是迫切需要的。

Y.lipolytica在1942年首次被分離得到，是研究最為廣泛的非常規酵母之一，可應用于生產有機酸、酶（蛋白酶、脂肪酶、酯酶及磷酸酶）、單細胞蛋白及單細胞油脂等。Y.lipolytica曾經作為關于生理學、遺傳學、二態性、基因控制、蛋白質表達及脂質積累研究的模式系統[17]。Y.lipolytica可利用葡萄糖、乙醇、乙酸及疏水性基質（如烷類、脂肪酸類及油）等作為碳源，且可分泌有機酸及蛋白質等代謝產物。20世紀末，人們將其開發成一種具有異源蛋白表達潛力的新型優良酵母表達系統。近年來，Y.lipolytica作為異源蛋白表達宿主的研究進展很快[18]。Y.lipolytica自身具備對常用抗生素的抗性，應用中一般選擇營養型標記，如LEU2、URA3，這樣避免了抗生素基因帶來的安全性問題[19]。目前，Y.lipolytica被認為是非致病性的，FDA將其劃定為Generally Regarded As Safe（GRAS），可以用于食品和藥物生產領域。

作者將Aspergillus niger BBE11721葡萄糖氧化酶基因在解脂耶氏酵母中進行表達，宿主為符合食品安全要求的營養缺陷型Yarrowia lipolytica菌株，構建了一株高效分泌GOD的重組菌Yarrowia lipolytica 1-28。該重組菌發酵過程無需添加抗生素，無甲醇誘導，食品安全性較高。通過單因素及正交實驗對Yarrowia lipolytica 1-28生產GOD的發酵培養基在搖瓶水平進行了優化，并在3 L發酵罐上進行了初步的發酵條件探索，為后續工業化的開發研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

E.coliJM109用于構建和增值重組質粒；質粒pPIC9K/GOD用于Aspergillus niger葡萄糖氧化酶基因擴增的模板；Y.lipolyticaPo1h （Ura-，△AEP，△AXP，Suc+）為表達宿主；質粒pINA1297用于構建重組載體。以上均由江南大學生物工程學院生物系統與生物加工工程研究室提供。

1.2 培養基

LB 培養基（g/L）：氯化鈉 10，蛋白胨 10，酵母粉 5。

YPD 培養基（g/L）：葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母粉10。

YNB 培養基（g/L）：葡萄糖 20，YNB1.7，硫酸銨 5。

PPB 培養基（g/L）：蔗糖 20，酵母提取物 1.32，氯化銨1.32，磷酸二氫鉀0.32，無水硫酸鎂0.132，維生素B13.34×10-4；溶于pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中[20]。

固體培養基在此基礎上添加2 g/dL瓊脂粉。

1.3 培養方法

Y.lipolytica種子培養條件：從-80℃保藏的工程菌甘油管點至YPD固體培養基，28℃培養過夜，用接種針挑取單菌落接種于YPD液體培養基中，于28℃培養18~24 h，轉速為200 r/min。

Y.lipolytica發酵培養條件：采用PPB培養基，接種體積分數為10%，于28℃培養，轉速為200 r/min，培養至發酵結束。

3 L發酵罐培養條件：罐裝液量1.0 L（優化后PPB培養基），接種體積分數10%，攪拌轉速600 r/min，通氣量2.0 vvm。當溶氧第一次反彈且大于60%時開始流加50 g/dL甘油，并調整轉速600~800 r/min以維持溶氧不高于30%。

1.4 DNA操作

1.4.1 質粒DNA提取 使用從上海生物工程公司購買的質粒提取試劑盒完成質粒提取，實驗步驟參照說明書進行。

1.4.2 限制性酶切反應 限制性酶切反應使用從TaKaRa公司購買的限制性內切酶完成，實驗步驟參照說明書進行。

1.4.3 DNA片段回收 DNA片段的回收使用從TaKaRa公司購買的膠回收試劑盒完成，實驗步驟參照說明書進行。

1.4.4 DNA定點突變方法 DNA定點突變引物設計及操作使用從TaKaRa公司購買的突變試劑盒完成，實驗步驟參照說明書進行。

1.4.5 酵母基因組提取 酵母基因組的提取使用從北京天根公司購買的酵母基因組提取試劑盒，實驗步驟參照說明書進行。

1.4.6 大腸桿菌感受態細胞制備及轉化方法 大腸桿菌感受態細胞的制備采用TaKaRa公司兩步法試劑盒制備。

1.4.7Y.lipolytica感受態細胞的制備及轉化 采用醋酸鋰轉化法[21]進行Y.lipolytic感受態細胞的制備與轉化。

1.5 Aspergillus niger GOD基因的克隆與分析

以含有Aspergillus nigerGOD基因的重組質粒pPIC9K/GOD為模板，根據NCBI數據庫中GOD基因序列設計含SfiⅠ和BamHⅠ酶切位點的兩端引物，采用50 μL反應體系進行PCR反應，參數為：95℃預變性5 min；95℃變性30 S，52℃退火30 S，72℃延伸2 min，34個循環；72℃延伸10 min。引物序列如下：

上游引物 P1：5′-TACGGCCGTTCTGGCCAATG GCATTGAAGCCAGCCTC-3′（下劃線為SfiⅠ酶切位點）

下游引物 P2：5′-CGCGGATCCTTCACTGCATG GAAGCATAATCTTCC-3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點）

按照TaKaRa公司膠回收試劑盒中的實驗步驟進行回收PCR產物。

1.6 表達載體pINA1297/GOD的構建與轉化

將用引物P1和P2進行PCR得到的產物與pINA1297用SfiⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，用柱回收試劑盒回收目的基因，膠回收試劑盒回收載體片段，然后兩者經T4連接酶連接過夜，連接液轉化到E.coliJM109。用含100 μg/mL氨芐霉素的LB平板篩選陽性轉化子，提取質粒，經上海生工測序正確，得到重組載體 pINA1297/GOD。將重組載體轉化Y.lipolyticaPo1h，提取酵母DNA，PCR擴增鑒定陽性轉化子。

1.7 分析方法

1.7.1 菌體生物量的測定 測定菌液在分光光度計600 nm波長處的吸光度值，即OD600。1.7.2 GOD酶活力測定 參照文獻[22]。

1.7.3 殘余甘油濃度測定 Nash比色法測定甘油質量濃度[23]。

2 結果與分析

2.1 重組菌株的構建

將轉化后菌液涂布篩選平板YNBcasa，挑取長出的菌落，采用菌落PCR鑒定其是否為重組子，成功篩選出陽性單菌落，見圖2。

圖2 菌落PCR驗證Fig.2 Picture of colony PCR

2.2 GOD基因在Y.lipolytica Po1h中的分泌表達

陽性轉化子在YPD平板上活化培養一定階段，接種到種子液體培養基YPD中，24 h后轉接至發酵培養基PPB中，28℃培養120 h，測定GOD酶活。

轉化子發酵測酶活得到一株產酶能力較強的菌株Yarrowia lipolytica1-28，培養120 h后酶活達到6.4 U/mL，是野生型黑曲霉分泌所得酶活的2.8倍。利用SDS-PAGE分析重組GOD在Y.lipolytica中的表達情況，結果見圖3。重組解脂耶氏酵母產生的GOD與黑曲霉GOD蛋白質的理論相對分子質量65 600[24]接近。

2.3 碳源對菌體生長和GOD酶活的影響

按照碳源質量分數相等的原則，將初始PPB培養基中的蔗糖分別替換為甘油、葡萄糖、山梨醇、乳糖、果糖和麥芽糖6種碳源以探究不同碳源種類對重組菌發酵的影響。如圖4所示，碳源替換為甘油、果糖和葡萄糖時，對重組菌的生長影響不大；而以麥芽糖、乳糖和山梨醇為碳源時，菌體量顯著降低。當以甘油為碳源時，GOD產量顯著提高，達到8.2 U/mL，比對照提高了30%。而以其他原料為碳源時，酶活均降低。因此，選擇甘油作為碳源生產GOD。

圖3 重組菌Y.lipolytica 1-28表達GOD的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of GOD in Y.lipolytica 1-28

圖4 不同碳源對菌體生長和GOD酶活的影響Fig.4 Effects of different carbon sources on cell growth and GOD production

進一步探究甘油濃度對重組菌發酵的影響。如圖5所示，甘油質量濃度在10~40 g/L，甘油質量濃度的提高對菌體的生長有促進作用；當甘油質量濃度在10~30 g/L之間時，GOD產量隨菌體量的提高而增加，可能是由于甘油量的增加促進了菌體的生長，從而影響產酶；結果表明，初始甘油質量濃度30 g/L對產酶的影響最好，GOD酶活最高達到10.9 U/mL；當甘油質量濃度高于30 g/L時，隨著甘油質量濃度的增加，GOD酶活下降，這可能是由于過多的甘油對菌體產酶產生了抑制作用。結合菌體生長與產酶性能，確定甘油的初始質量濃度為30 g/L。

2.4 氮源對菌體生長和GOD酶活的影響

在上述實驗的基礎上進一步優化培養基中的氮源，將初始PPB培養基中的酵母提取物和氯化銨按照氮源質量分數相等的原則替換為其它氮源。如圖6所示，菌體細胞對尿素的利用率較高，而對硝酸鉀的利用率最低，OD600值僅為10，對酵母提取物、蛋白胨、氯化銨的利用效果差異不大。結果表明，選擇酵母提取物作為單一氮源，產酶效果最佳，酶活達到10.3 U/mL，而蛋白胨及兩種復合氮源對GOD的產量影響不大，尿素、硝酸鉀和氯化銨均使產酶量降低。針對菌株產GOD能力，選擇酵母提取物作為氮源。

圖5 甘油質量濃度對菌體生長和GOD酶活的影響Fig.5 Effects of concentration of glycerol on cell growth and GOD production

圖6 不同氮源對菌體生長和GOD酶活的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on cell growth and GOD production

2.5 無機鹽對菌體生長和GOD酶活的影響

在上述實驗的基礎上，將培養基中的無水硫酸鎂分別替換為七水硫酸鋅、硫酸錳、七水硫酸亞鐵、無水氯化鈣以及四水合鉬酸銨。如圖7所示，相較于無水硫酸鎂，其它無機鹽對酵母的生長和產酶并沒有提高，均呈現下降趨勢。

2.6 pH對菌體生長和GOD酶活的影響

進一步探究培養基初始pH值對重組酵母菌株發酵的影響。將培養基的初始pH值分別控制為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0， 進行重組菌株發酵培養，實驗結果見圖8。初始pH值為6.0時，重組菌菌體量最高，OD600值達到15，酶活也達到最高，為10.1 U/mL。因此，選擇發酵培養基的初始pH值為6.0。

圖7 不同無機鹽對菌體生長和GOD酶活的影響Fig.7 Effects of different mineral salt growth on cell growth and GOD production

圖8 不同初始pH對菌體生長和GOD酶活的影響Fig.8 Effects of pH on cell growth and GOD production

2.7 發酵培養基的正交設計優化

結合單因素實驗結果，選擇甘油、酵母提取物、氯化銨及硫酸鎂進行四因素三水平的正交實驗設計，以確定重組菌株的最佳發酵條件。因素與水平設計表見表1，實驗結果見表2。

表1 正交實驗因素和水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

表2 正交實驗結果與分析Table 2 Analysis of the orthogonal experimental results

根據實驗結果分析，對葡萄糖氧化酶酶活影響的主次順序為：酵母提取物＞無水硫酸鎂＞甘油＞氯化銨，最佳組合：甘油20 g/L、酵母膏2.64 g/L、氯化銨2.64 g/L、無水硫酸鎂0.13 g/L。

2.8 搖瓶發酵條件優化前后GOD酶活對比

通過以上實驗，初步優化得到重組菌株產GOD的發酵培養基為：甘油20 g/L，酵母膏2.64 g/L，氯化銨2.64 g/L，無水硫酸鎂0.13 g/L，磷酸二氫鉀0.32 g/L，維生素 B13.34×10-4g/L，初始 pH 值 6.0，發酵溫度28℃。優化前后重組菌的發酵情況見圖9。優化后GOD產量明顯提高，酶活達到11.0 U/mL，較優化前GOD產量提高了72%。

2.9 3 L罐上GOD的發酵生產

前述研究了重組菌株Yarrowia lipolytica 1-28在搖瓶水平上的發酵條件優化，在此基礎上，對3 L發酵罐上Yarrowia lipolytica 1-28生產GOD的發酵過程進行了初步研究。將重組菌Y.Lipolytica 1-28以10%的接種體積分數接種至3 L發酵罐中，當DO反彈且大于60%時開始流加甘油以表達重組蛋白。由于甘油流加時間過長或流速過快時，產酶均受到抑制，因此選擇短時流加甘油，甘油流速為7.5 g/h，總共流加甘油量為20 g/L。3 L發酵罐流加甘油發酵生產的過程見圖10。在整個發酵過程中，菌體量顯示穩步增加，后達到平穩狀態，最終達到35 g/L。發酵前期隨著菌體量的增長，溶液pH先下降至pH 3.1，隨后反彈，甘油停止流加后，pH很快上升直至8.5左右。發酵過程持續200 h，在172 h處酶活最高，達18.9 U/mL。

2.10 改進pH控制策略

pH控制方式對產物的積累起著重要的作用[25]。綜合發酵情況可以看出，在pH自然變化的情況下，發酵液的pH先維持較低水平，發酵后期pH升高到較高水平，前后pH變化范圍較大。且在pH上升至5.0左右時，GOD開始快速積累。為了充分發揮解脂耶氏酵母的發酵性能，分別控制發酵液pH為4.0、5.0、6.0，在3 L罐上進行研究。

如圖11所示，控制pH對Y.Lipolytica 1-28產GOD產生較大影響，GOD酶活得到顯著的提高。當控制pH分別為4.0和5.0時，GOD的酶活差異不大，其最高酶活分別為57.9 U/mL和61.0 U/mL。而當pH控制為6.0時，GOD最高酶活相對較低，為40.9 U/mL。

圖11 pH對Y.Lipolytica 1-28在3 L罐上發酵的影響Fig.11 Fermentation result of Y.Lipolytica 1-28 at a 3L bioreactor with pH control

2.11 甘油補料對3 L罐發酵產酶的影響

在3 L發酵罐上，用4 M NaOH和2 M H2SO4控制pH恒定為5.0，分別考察了不補料和甘油補料20 g/L（見章節 3.10）、30、40、50 g/L 的產酶情況。 結果如圖12所示。

在不補料情況下，調控發酵液pH為5.0，GOD的最高酶活為21.2 U/mL。在甘油補料30 g/L，發酵190 h，發酵液酶活達到最高為81.6 U/mL，與3.10中甘油補料為20 g/L相比，提高33.8%。甘油補料40 g/L和50 g/L時，甘油過剩對產酶產生了抑制作用，且產酶期延長，其GOD最高酶活分別為30.6 U/mL和25.9 U/mL。

圖12 甘油補料對Y.Lipolytica 1-28在3 L罐上發酵的影響Fig.12 Time-course of fed-batch fermentation by Glycerol feeding

3 結 語

作者構建了分泌表達黑曲霉來源葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母重組菌株，通過單因素實驗與正交實驗，得到優化后發酵培養基組成如下：甘油20 g/L，酵母膏 2.64 g/L，氯化銨 2.64 g/L，無水硫酸鎂0.13 g/L，磷酸二氫鉀 0.32 g/L，維生素 B1 3.34×10-4g/L，初始pH值6.0，28℃發酵。采用優化培養基及發酵條件培養重組菌株，GOD發酵酶活達到11.0 U/mL，較優化前GOD產量提高了72%。在3 L發酵罐上，采用在搖瓶水平上的最優營養條件，進一步進行了pH控制和甘油流加策略的研究。在調控pH為5.0恒定，短時流加甘油量為30 g/L時，GOD酶活可達到81.6 U/mL。綜上所述，通過pH控制策略和流加發酵策略的優化對重組解脂耶氏酵母產GOD有顯著的提高，為食品安全級菌株高產葡萄糖氧化酶的工業生產奠定了基礎。