礦泉水中銅綠假單胞菌檢測能力驗證結果評價

◎ 楊秋玲，季婧涵，黃小方，林曉娟

（南平市食品藥品檢驗檢測中心，福建 南平 353000）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aernginosa）又稱綠膿桿菌，是一種常見的食源性和水源性致病菌，它極易在水中及含水量較高的食品中存活并繁殖，對消毒劑、紫外線等理化因素具有很強的抵抗力，可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病[1-3]。因此，準確而快速地檢出銅綠假單胞菌，在保障人民飲食用水安全和評價檢驗檢測機構檢驗能力方面就顯得尤為重要。能力驗證是一種有效確認實驗室內部質量控制的方法，同時對檢測人員技術水平的提高和質量管理體系的完善起到積極的作用[4]。目前，銅綠假單胞菌的檢測主要采用國標法，檢測時間至少2 d，且對操作人員的技術要求很高，不利于快速檢測。近年來，隨著分子生物學的快速發展，實時熒光定量PCR由于檢測時間短、操作簡單、且特異性強等優勢而被廣泛的運用于病毒和食源性致病菌的檢測。參加本次能力驗證旨在通過對銅綠假單胞菌的檢測，確定本實驗室具備檢測該菌的能力，同時通過對比分析實時熒光定量PCR法以及國標法的檢測結果，為今后水中銅綠假單胞菌的快速、高效、準確檢測提供有價值的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品來源和標準菌株

樣品18-U262和樣品18-N396，由中國檢驗檢疫科學研究測試評價中心提供。標準菌株銅綠假單胞菌（FSCC 206004）和熒光假單胞菌（GDMCC1.344），均從廣東省食品微生物安全工程技術研究開發中心購買。

1.2 主要儀器

CFX96-Touch Deep WellTM實時熒光定量PCR儀、Centrifuge 5418臺式離心機、CHB-T2-B恒溫金屬浴、ND-ONE-W超微量分光光度計、2018614渦旋混合器、SHP-350生化培養箱、G154DW立式自動壓力蒸汽滅菌器、HTY-305G微生物限度檢驗儀、ZF-1三用紫外分析儀以及AC2-4S1生物安全柜等。

1.3 主要試劑

綠膿桿菌核酸測定試劑盒，購自上海之江生物科技股份有限公司；營養肉湯、CN瓊脂及配套試劑、綠膿菌素測定培養基等，購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.4 樣品的制備

將樣品用520 mL無菌水再水化，制成待測樣品原液。取待測樣品原液60 mL加入到540 mL的無菌水中制成1∶10的樣品勻液；按相同的方法制備1∶100、1∶1 000的樣品勻液，備用。

1.5 銅綠假單胞菌的實時熒光定量PCR法

取25 mL待測樣品原液通過孔徑0.45 μm的濾膜過濾，將濾膜轉移至100 mL營養肉湯中，增菌18 h后，取增菌液1.5 mL，13 000 r·min-1離心2 min；棄上清液，沉淀中直接加入100 μL DNA提取液充分混勻，沸水浴10 min。13 000 r·min-1離心5 min，取上清液備用。DNA的擴增根據上海之江生物科技股份有限公司綠膿桿菌核酸測定試劑盒（熒光PCR法）的說明書進行。

1.6 銅綠假單胞菌的國標法

根據GB 8538-2016 食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法的銅綠假單胞菌-濾膜法，將250 mL水樣或稀釋液通過孔徑0.45 μm的濾膜過濾，然后將濾膜平鋪在制備好的CN瓊脂平板上,將平板倒置于36 ℃培養24～48 h，觀察結果；同時做陽性和陰性對照[5]。

2 結果與分析

2.1 實時熒光定量PCR法檢測結果

用實時熒光定量PCR法檢測2份待測樣，結果2份待測樣品均檢出銅綠假單胞菌，結果如圖1所示。從圖1可以看出，樣品18-U262和樣品18-N396的樣品經過PCR擴增出的曲線和內部陽性對照樣的曲線一致，FAM通道的Ct值均≤35，說明檢測結果陽性。

圖1 樣品18-U262和樣品18-N396實時熒光定量PCR結果圖

2.2 國家標準法檢測結果

按國家標準GB 8538-2016法對2份待測樣品進行檢測，結果在CN平板上的菌落形態如下：陽性對照組有藍綠色菌落生長，陰性對照組有黃綠色菌落生長；樣品18-U262和樣品18-N396的樣品有藍綠色菌落和其他菌落生長，挑取藍綠色菌落，通過綠膿菌素試驗，被檢物里面均存在綠膿菌素，判定檢測結果陽性，計數所有藍綠色菌落，結果見表1。樣品18-U262的報出值為4 600 CFU/250 mL，樣品18-N396的報出值為2 200 CFU/250 mL。

表1 CN平板上的銅綠假單胞菌菌落數表

3 結論

本實驗室通過參加由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心組織和負責實施的對2份礦泉水盲樣中銅綠假單胞菌的檢測能力驗證，樣品18-U262的檢測結果為4 600 CFU/250 mL，樣品18-N396的檢測結果為2 200 CFU/250 mL，評價中心按照ISO 13528-2015標準，利用參加實驗室的結果計算了能力評價統計量得出本次試驗的Z值分別為0.5和0.3，能力評價準則結果|Z|均小于2，評價結果滿意，說明本實驗室具有檢驗該菌的能力。

在本實驗中，實時熒光定量PCR法與國標法對銅綠假單胞菌的檢出結果皆為陽性，該方法與傳統國標法相比具有取樣量小，檢測時間短、操作簡單等優點，因此，可將qPCR法輔助國標法對水中的銅綠假單胞菌進行快速檢測和結果初篩，提高其檢測效率，同時也為其他微生物的快速、高效、準確的檢測提供有價值的參考和借鑒。