微生物法測定大米中葉酸含量的研究

◎ 趙 平，郭瑩瑩，楊 光，王哲明，丁松喬

（1.黑龍江省質量監督檢測研究院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.國家農業標準化監測與研究中心（黑龍江），黑龍江 哈爾濱 150028）

葉酸是一種水溶性維生素，為維生素B復合體之一，又叫維生素B9，人類如果缺乏葉酸，會引起巨幼紅細胞貧血與白細胞減少癥。天然葉酸廣泛存在于動植物類食品中，尤以肝及綠葉蔬菜中含量比較多[1-2]。

大米是人們生活中的主食之一，其富含豐富的B族維生素，可為人體提供所需的維生素。本實驗應用微生物法來測定分析大米中原生葉酸的含量，以鼠李糖乳桿菌為測試菌種，葉酸是其生長必需的營養素，利用其對葉酸的特異性，通過其生長測定大米中原生葉酸的含量，建立大米中原生葉酸含量測定的方法[3-5]。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗試樣

大米，產地為黑龍江。

1.2 實驗試劑與實驗菌種

葉酸標準品（≥99%），磷酸氫二鈉，抗壞血酸，鹽酸，氫氧化鈉，木瓜蛋白酶，α-淀粉酶，雞胰腺，0.85%氯化鈉溶液，葉酸測定用培養基，乳酸桿菌肉湯培養基，鼠李糖乳桿菌Lactobacillus casei spp.rhamnosus（ATCC 7469）。

1.3 實驗設備與儀器

天平（感量0.1 mg），恒溫震蕩培養箱，離心機，電熱鼓風干燥箱，生化培養箱，液體分裝泵，pH計，潔凈臺，分光光度計，微量移液器，高壓蒸汽滅菌釜，渦旋振蕩儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 玻璃器皿的準備

將玻璃儀器清洗干凈，然后烘干備用。

1.4.2 實驗菌種的制備

將鼠李糖乳桿菌Lactobacillus casei spp.rhamnosus（ATCC 7469）甘油管（實驗室保存）無菌操作轉接至乳酸桿菌肉湯中，37 ℃搖床培養24 h，備用。

塔巴林，藏語意為“解脫園”，修建于清乾隆三十六年（1771年），相傳是噶丹東竹林寺第三世扎唐活佛倡建。當時，在距寺院約有五里的林地中，有一處尼姑庵，只有幾名尼姑住在簡易木棚中修習。另外在奔子欄鎮支央村有一處小的尼姑庵，也只有幾名尼姑，僧舍也極其落魄。鑒于迪慶境內沒有一座像樣的尼姑寺，三世扎唐活佛決定合并兩處小的尼姑庵，用內地買來的布匹換下現今的寺址（寺址原來是東竹林寺所在地），并命名為“塔巴林”，為廣大女性信徒提供了一處修行地。

1.4.3 試樣的制備與提取

準確稱取大米試樣（經粉碎，過篩）10 g，至150 mL錐形瓶中。加入20 mL磷酸鹽緩沖液Ⅱ（14.2 g磷酸氫二鈉，用1 000 mL水溶解。臨用前按1.0 g/100 mL加入抗壞血酸，用氫氧化鈉溶液調pH至7.7～7.9），混勻后加50 mL水和1.0 mL甲苯。加蓋后121 ℃滅菌15 min，然后迅速冷卻。加1mL木瓜蛋白酶溶液，于（36±1）℃保溫3 h后100 ℃加熱3 min，冷卻。加1 mL α-淀粉酶溶液，（36±1）℃保溫2 h后加4 mL雞胰腺，加蓋，（36±1）℃保溫16 h后100 ℃加熱3 min，冷卻。用1 mol/L鹽酸調pH至4.5，用水稀釋定容到100 mL。過濾得到澄清濾液，然后吸取1 mL澄清濾液用磷酸鹽緩沖液Ⅲ（14.2 g磷酸氫二鈉，用1 000 mL水溶解。臨用前按1.0 g/100 mL加入抗壞血酸，用氫氧化鈉溶液調pH至6.7～6.9）定容至100 mL。同時做空白對照。

1.4.4 葉酸標準曲線管制備

取試管分別加入實驗用水（GB/T 6682-2008規定的二 級 水）5.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0、2.0、1.0、0.0 mL，每支試管中加入5.0 mL葉酸測定用培養基，再按相應順序加入葉酸標準工作液（0.05 ng·mL-1）0.0、0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 和標準工作液（0.1 ng·mL-1）3.0、4.0、5.0 mL，相當葉酸含量為0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40 ng和0.50 ng，每個梯度做3支平行管，試管加塞，121 ℃滅菌5 min。

1.4.5 試樣系列管的制備

取4支試管，分別加入4.0、3.0、2.0、1.0 mL水，試樣提取液，1.0、2.0、3.0、4.0 mL，然后加入5.0 mL葉酸測定用培養基。每個梯度做3支平行管。試管加塞，121 ℃滅菌 5 min。

1.4.6 接種液的制備

菌種活化好后，將菌懸液無菌條件下離心棄去上清，用無菌生理鹽水離心洗滌菌體，棄上清，反復2～3次。以生理鹽水做對照，用分光光度計測試菌液透光率，將菌液透光率調至為73%，備用。

試管滅菌后，冷卻，每支試管以無菌操作方式接入調好的菌液50 μL，標準曲線管中未接種葉酸標樣的S1空白管除外。置37 ℃生化培養箱中培養20 h。

1.4.8 葉酸標準曲線的測定與繪制

目測檢查試管，S1未接種菌液管應是澄清的，如有混濁出現，則無效。用渦旋振蕩器混合每一支試管中培養液后，將培養液移入比色皿中波長550 nm處測定吸光度。以吸光度OD值為橫坐標，葉酸標準品的含量（ng）為縱坐標繪制標準曲線。

以S2接種空白管為空白調零，測試每支試管的OD值。

通過葉酸標準曲線，用OD值來計算每毫升培養液中葉酸的含量，并計算該編號的葉酸含量的平均值。用該平均值計算得出全部編號的總平均值為Cx。

葉酸含量

式（1）中：X為葉酸含量，μg/100g；Cx為總平均值，ng；m為質量，g；f為稀釋倍數；EB為雞胰腺空白管中葉酸含量，ng/mL。

2 結果與分析

2.1 葉酸標準曲線的繪制

培養20 h后，OD值在葉酸含量為0～0.5 ng范圍內的線性良好，以吸光度為橫坐標（x）、葉酸含量為縱坐標（y）繪制葉酸標準曲線為y=1.3024x2+0.4676x，r=0.996 6，如圖1所示。

圖1 吸光度與葉酸含量標準曲線圖

2.2 重復性試驗

同一批次大米樣，精密稱取10次，依照此方法測定葉酸的含量，結果表明方法的重現性良好，見表1。由表1可得，10次檢測的平均值為12.4 μg/100 g，RSD為0.03%。

表1 重復性試驗結果表

2.3 回收率試驗

精密稱取同一批次大米樣品6份，2份樣品做平行實驗測出大米的本底葉酸含量，其余4份樣品進行加標實驗，測定葉酸含量并計算葉酸加標回收率，結果計算得出回收率分別為98.9%、98.4%、97.8%、95.3%，平均回收率為97.6%，RSD為0.016%。

3 結論

本實驗通過利用微生物法對大米中原生葉酸含量的測定分析，測得大米樣品中原生葉酸含量的RSD為0.03%（n=10），平均回收率達97.6%。表明微生物法測定大米中原生葉酸含量的方法重現性好、精密度高、可靠性強、靈敏度高、樣品的制備與葉酸提取操作簡單，適用于大米中原生葉酸含量的測定。