蠟樣芽胞桿菌鑒定方法研究

◎ 蘇佩冰，梁梅娟，陳靖欣，殷 歡

（中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 中山 528437）

蠟樣芽孢桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性芽孢菌，呈桿狀，大小為（1.0～1.2）μm×（3.0～5.0）μm，可在菌體內(nèi)形成圓形或橢圓形芽孢[1]。蠟樣芽孢桿菌普遍分布在水、土壤、空氣中，極易污染食品[2]。被蠟樣芽孢桿菌污染的食品在室溫下放置，細(xì)菌繁殖較快，達(dá)到一定量并食入后會(huì)產(chǎn)生腸毒素。由于該菌從外觀、氣味上無(wú)顯著變化，食入后會(huì)引起食源性疾病即食物中毒[3]。且其在乳品、豆制品、剩米飯、肉制品、干制品（奶粉、面粉）等淀粉含量較高的食物中污染較重。因此，常被作為主要監(jiān)測(cè)的食源性致病菌之一[4]。

目前，對(duì)于蠟樣芽孢桿菌的鑒定方法主要有生化鑒定方法、Riboprinter核糖體分型法、VITEK2 Compact、API50 CHB檢測(cè)法等。本文對(duì)這4種方法進(jìn)行研究，看是否能鑒定出蠟樣芽孢桿菌與其類似菌。

1 材料與方法

1.1 菌株

蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌[CMCC（B）63303]、蕈狀芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌（ATCC 10206）、蘇云金芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌（ATCC 10792）、可疑菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)的生化試劑及培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、過(guò)氧化氫溶液、酪蛋白瓊脂、TSSB、瓊脂硫酸錳營(yíng)養(yǎng)瓊脂、革蘭氏染液、0.5%堿性復(fù)紅、蠟樣芽孢桿菌生化試劑盒。

1.3 鑒定方法

1.3.1 GB 4789.14-2014

生化鑒定通過(guò)革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶、酪蛋白分解實(shí)驗(yàn)、生化鑒定試劑盒[動(dòng)力實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、溶菌酶耐性實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、葡萄糖利用（厭氧）實(shí)驗(yàn)]、根狀生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。1.3.2 VITEK 2 Compact檢測(cè)方法

VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)把細(xì)菌必須的生化反應(yīng)培養(yǎng)基固定在卡片上，培養(yǎng)后通過(guò)卡片的顯色讀取到系統(tǒng)中[5]。用BCL卡將3種標(biāo)準(zhǔn)菌和可疑菌上機(jī)，14.25 h后通過(guò)電腦讀取結(jié)果。

1.3.3 API50 CHB檢測(cè)方法

API 50 CH是采用50個(gè)生化實(shí)驗(yàn)對(duì)微生物的碳水化合物的代謝進(jìn)行研究。API CH與API CHB培養(yǎng)基配合使用，用以鑒定芽孢桿菌及相關(guān)細(xì)菌，腸桿菌科細(xì)菌和弧菌科細(xì)菌。按操作說(shuō)明將目標(biāo)菌制成菌懸液用API 50 CH試劑條和API 20E試劑條在30 ℃下培養(yǎng)24～48 h。再將結(jié)果錄入API 50 CHBV4.0鑒定軟件進(jìn)行結(jié)果的判讀。

1.3.4 RiboPrinter核糖體分型方法

RiboPrinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)基于核糖體分型技術(shù)，使用常用限制性內(nèi)切酶（如EcoR Ⅰ、PvuⅡ、Pst Ⅰ等）消化目標(biāo)菌基因組產(chǎn)生的基因片段，基因片段經(jīng)過(guò)電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與DuPont專門設(shè)計(jì)的DNA探針雜交，該探針編碼與16S rRNA、23S rRNA、5S rRNA和間隔序列高度相似，雜交后通過(guò)化學(xué)發(fā)光原理產(chǎn)生的信號(hào)由相機(jī)捕獲傳至工作站產(chǎn)生“條形碼”狀條帶圖像（RiboPrinter 模式）基因指紋圖，將基因指紋圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)菌株基因指紋圖譜比較，達(dá)到細(xì)菌鑒定和分型的目的。檢測(cè)時(shí)按照操作規(guī)程挑取純菌落在緩沖液中加熱滅活，最后上機(jī)，通過(guò)8 h在機(jī)里的操作，得到鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 GB 4789.14-2014生化鑒定的結(jié)果

GB 4789.14-2014生化鑒定的結(jié)果見表1。

表1 蠟樣芽孢桿菌與類似菌生化鑒定表

革蘭氏染色在油鏡下觀察，可疑菌、蘇云金芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌從形態(tài)結(jié)構(gòu)上無(wú)太大區(qū)別，蕈狀芽孢桿菌呈長(zhǎng)條狀。從表1可看出，10個(gè)生化實(shí)驗(yàn)有8個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，只有根狀生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和蛋白毒素結(jié)晶實(shí)驗(yàn)?zāi)芸吹讲灰粯印Ｔ诟鶢钌L(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，蕈狀芽孢桿菌在營(yíng)養(yǎng)瓊之平板中呈毛玻璃似的根狀生長(zhǎng)，蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和可疑菌則呈融蠟狀、山谷狀生長(zhǎng)[6]。在蛋白質(zhì)毒素晶體實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)染色鏡檢觀察到蘇云金芽孢桿菌淺紅色的游離芽孢和深紅色的菱形晶體。從結(jié)果可知，僅僅依靠革蘭氏染色和8個(gè)生化實(shí)驗(yàn)無(wú)法區(qū)分出三者，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此只能作為輔助手段。根狀生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)可以有效鑒定蕈狀芽孢桿菌，蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶實(shí)驗(yàn)則能有效鑒定蘇云金芽孢桿菌。

2.2 VITEK 2 Compact檢測(cè)的結(jié)果

VITEK 2 Compact檢測(cè)的結(jié)果見表2。

表2 蠟樣芽孢桿菌和類似菌VITEK 2結(jié)果表

表2結(jié)果顯示，蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌和可疑菌的鑒別中，無(wú)法準(zhǔn)確鑒別是哪種菌，需要結(jié)合蛋白毒素結(jié)晶實(shí)驗(yàn)、根狀生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。

2.3 API50 CHB檢測(cè)的結(jié)果

試劑條的結(jié)果只有蕈狀芽孢桿菌鑒定結(jié)果有90%以上，蠟樣芽孢桿菌、可疑菌和蘇云金芽孢桿菌無(wú)法鑒定出來(lái)。這種檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確的鑒定出蕈狀芽孢桿菌，但對(duì)于蠟樣芽孢桿菌的鑒定沒(méi)有太大幫助。

2.4 Riboprinter核糖體分型的結(jié)果

Riboprinter核糖體分型的結(jié)果見表3。

表3 蠟樣芽孢桿菌與類似菌Riboprinter核糖體分型表

目標(biāo)菌經(jīng)EcoRⅠ酶切與DNA探針雜交產(chǎn)生了清晰的指紋圖譜。從結(jié)果可知，Riboprinter核糖體分型方法可以鑒定出這4種菌，可疑菌的圖譜顯示該菌種是蠟樣芽孢桿菌可能性達(dá)到0.92。但由于實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)較少，還需要通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步確認(rèn)。

3 分析與討論

從4種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，蕈狀芽孢桿菌是比較容易鑒定的，可以通過(guò)形態(tài)，根狀生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)API 50 CHB將蕈狀芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、可疑菌區(qū)分開。但是蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌由于DNA結(jié)構(gòu)相似，只有個(gè)別堿基對(duì)有差異[7]，在這4種方法中，并沒(méi)有任何一種可以簡(jiǎn)單、高效的鑒定出兩者。一般都需要結(jié)合蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。API 50 CHB、VITEK 2 Compact、RiboPrinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)基于核糖體分型技術(shù)檢測(cè)方法只能作為鑒定方法的輔助工具，最終還是需要結(jié)合根狀實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶實(shí)驗(yàn)來(lái)完成確認(rèn)。RiboPrinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)基于核糖體分型技術(shù)檢測(cè)方法結(jié)合蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶實(shí)驗(yàn)可高效快速的鑒定出蠟樣芽孢桿菌。

4 結(jié)論

在蠟樣芽孢桿菌的鑒定中，通過(guò)RiboPrinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)基于核糖體分型技術(shù)檢測(cè)方法結(jié)合蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，以形態(tài)觀察和生化實(shí)驗(yàn)為輔助手段，可提高蠟樣芽孢桿菌鑒定的準(zhǔn)確性，降低假陽(yáng)性、假陰性出現(xiàn)的概率，解決蠟樣芽孢桿菌難鑒定的問(wèn)題。