干細胞冷凍保護劑的研究進展

張天鈺 綜述 周雙白 李青峰 審校

【提要】 干細胞具有促進組織修復與再生的作用，蘊藏著廣泛的臨床應用前景。低溫凍存是實現干細胞長期保存的常用方法。在低溫保存過程中，有效的冷凍保護劑（CPA）對于防止細胞低溫損傷和保持細胞活力至關重要。本文將對干細胞冷凍保護劑的研究進展進行綜述。

干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞，如胚胎干細胞、誘導多能干細胞以及間充質干細胞等，其在特定的條件下能分化成體內多種類型的細胞[1-3]。干細胞具有多種用途和功能，可用于體外研究組織器官的生長發育、建立疾病模型、藥物篩選，也可用于疾病治療，如組織修復與再生等[4-5]。干細胞的長期保存需要進行冷凍保存，但冷凍保存的過程對細胞具有一定的損傷。冷凍保護劑可保護細胞免受低溫凍存中的冷凍損傷，能更好地保存細胞的生物性能。本文將對近年來干細胞冷凍保護劑的研究進展進行綜述。

1 冷凍損傷的機制

組織和細胞雖可在-196 ℃低溫下長期保存，但易在降溫和復溫過程中受溶液凍結、融化以及溶液滲透壓變化等因素的作用而受到損害。冷凍損傷通常發生在0 ℃到-60 ℃的溫度范圍內。對于引起冷凍損傷的機制一直是低溫生物醫學的研究熱點，目前存在多種假說，比如電解質失衡假說、兩要素假說、生物膜損傷假說以及結構假說等[6]。其中，Mazur 等[7]提出了“兩要素假說”，認為引起細胞冷凍損傷的因素主要有以下兩種。

1.1 細胞內冰晶的形成（Intracellular Ice Formation，IIF）

高速率冷卻狀態下的細胞內水分子被快速凍結后，細胞不再進一步脫水，使其內部的水分子不能玻璃化，進而提高了細胞內冰晶的形成程度。冰晶會對細胞內的多種生物膜產生機械或者生物化學應力，導致細胞產生不可逆的損傷。研究表明，大的內部冰晶的存在是致命的[8]。細胞內冰晶是否對細胞造成嚴重損傷取決于冰晶的大小、位置、數量以及復溫條件[9-10]。復溫解凍時，緩慢升溫將使細胞內冰晶玻璃化之后的水形成結晶或重結晶，這將會對細胞造成致死性損傷。

1.2 溶液效應損傷

冰晶會誘導細胞內和細胞外溶液性質的改變，細胞長時間暴露于改變的內外溶液中將會產生低溫損傷，這些改變或溶液效應包括溶質的濃度、酸堿平衡、細胞膜內外滲透壓的改變以及嚴重脫水后溶質濃縮沉淀[11]。

2 冷凍保護劑作用機制

冷凍保護劑可以同溶液中的水分子結合，發生水合作用，弱化水的結晶過程，使溶液的黏性增加從而減少冰晶的形成[12]，同時冷凍保護劑可通過在細胞內外維持一定的摩爾濃度，降低細胞內外未結冰溶液中電解質的濃度，使細胞免受溶質的損傷。研究表明，細胞懸液中加入冷凍保護劑可保護細胞免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護劑根據其是否穿透細胞膜通常分為兩大類型：滲透性冷凍保護劑和非滲透性冷凍保護劑[13]。滲透性冷凍保護劑多為小分子中性物質，其作用為弱化水結晶過程以及減少對細胞結構和功能的破壞，主要包括甘油、二甲基亞砜（DMSO）、丙二醇、乙二醇、乙酰胺、甲醇等。非滲透性保護劑多為大分子物質，通過降低溶質濃度減少低溫凍存對細胞的傷害，主要包括海藻糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖、白蛋白等。

3 經典的冷凍保護劑及其存在的問題

經典的冷凍保護劑為10%DMSO，可加入10%～90%FBS（提供營養），因成本低廉、效果優良、易操作，而被廣泛應用于干細胞的冷凍保存[14]。然而，DMSO 作為經典的冷凍保護劑雖可降低保存液的冰點并減少胞內冰的形成，但是一系列的研究表明，DMSO 可能會改變染色體的穩定性，并導致細胞端粒長度的變化，反過來導致腫瘤的形成[15-16]；并且，DMSO 自身也具有一定的毒性[17]。DMSO 對組織和細胞的毒性取決于暴露時間、溫度和濃度，另外FBS 為異種動物組分，有引入人朊病毒而造成人畜共患病及導致免疫反應等風險[18]；同時，血清的組分、來源和生產批次，對培養的細胞可能會有不良或不一致的影響。

4 新型冷凍保護劑

無毒性、易洗脫以及無異種抗原是新型冷凍劑選用的原則。根據這一原則，近幾年來國內外最新研究報道了幾類新型冷凍保護劑。

4.1 無異種蛋白的冷凍保護劑

無異種蛋白的冷凍保護劑分為兩類。一類為人白蛋白冷凍保護劑，Park 等[19]使用人白蛋白替代了FBS，即生理鹽水+10%DMSO+9%人體白蛋白（HSA）凍存hADSC，凍存1 周后復蘇，與經典冷凍保護劑對比，細胞存活率和細胞表型均無顯著性差異，集落形成能力（CFU）、成脂、成骨和成軟骨實驗結果均好于經典冷凍保護劑。該冷凍保護劑不含有動物源性血清，不會引入外源蛋白，降低了動物病原污染的可能性。另一類為人血小板裂解物（PL）冷凍保護劑。Wang 等[20]通過使用97%人類血小板裂解物+3%DMSO、95%FBS+5%DMSO 以及90%FBS+10%DMSO 三組凍存液分別凍存hADSC，復蘇后發現三組細胞的存活率均高于80%；在無DMSO 冷凍保護劑存在的條件下，經過自身PL 處理過的hADSC 比FBS 處理過的hADSC 擁有更高的存活率、更好的成骨分化能力以及更短的倍增時間。這種冷凍保護劑無任何動物成分和異源性成分，可減少DMSO 的濃度，同時可釋放多種生長因子促進hADSC 體外增殖，但對于PL 促進細胞生長的機制及其在其他干細胞中的凍存效果還需進一步了解[21]。

4.2 海藻糖

海藻糖無毒，易洗脫，在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環境條件下，能在細胞表面形成獨特的保護膜，具有較高的玻璃轉變溫度[22-23]，可防止細胞內冰晶的形成。婁琳等[24]分別使用不同濃度的海藻糖凍存造血干細胞，凍存后通過錐蟲藍拒染法檢測細胞存活率和CD34-PE/CD45-FITC 雙標法流式細胞儀檢測CD34+細胞回收率（凍存后值/凍存前值×100%）。實驗證明，海藻糖對于短期內低溫凍存的造血干細胞有一定的保護作用，其中0.5 M 的海藻糖凍存效果最好。Martinetti 等[9]分別使用不同濃度的海藻糖和經典冷凍保護劑凍存人外周血干細胞，復蘇后檢測細胞活性和增殖能力。結果顯示，1.0 M 海藻糖凍存效果好于經典的冷凍保護劑。在此基礎上，Ntai 等[25]分別使用不同濃度的滲透性冷凍劑和非滲透性冷凍保護劑相結合來凍存人的多能干細胞，凍存1 周后復蘇，通過測定細胞活性、染色體的穩定性以及基因毒性等檢測，證實0.5 M 海藻糖結合10%甘油凍存多能干細胞的效果好于單獨使用海藻糖。

4.3 含0.5%瓊脂糖液體彈珠（Liquid Marbles，LM）

LM 是被高疏水性顆粒包裹形成的不潤濕的液滴，可穩定地黏附于固體及液體表面，是一種凍存細胞的新型材料[26]。有研究使用含有0.5%瓊脂糖和50% FBS 的LM 凍存鼠的3T3 細胞和L929 成纖維細胞，復蘇后發現，不管是在細胞形態、細胞存活率還是細胞增殖方面，均好于傳統凍存劑，與新鮮細胞無明顯差異[27－28]。但是，LM 中含有FBS 成分，對于如何去除FBS 還有待于進一步研究。

4.4 羥乙基淀粉（Hydroxyethyl Starch，HES）

HES 是一種非滲透性保護劑，不僅可以在冷凍過程中減少細胞內冰晶的形成，還可降低DMSO 的濃度，減少對細胞的損傷。魯瑞周等[29]使用5%DMSO+HES 冷凍保護劑凍存臍帶造血干細胞，與10%DMSO 冷凍保護劑凍存過的細胞比較，發現兩者雖然在細胞存活率方面無顯著差異，但前者的粒-巨噬細胞集落回收率（CFU-GM）明顯更高，且存在顯著性差異。李雯瑛等[30]使用DMSO+HES 聯合冷凍保護劑凍存外周造血干細胞，凍存2 周后復蘇，發現細胞的存活率以及CFUGM 均達90%。

4.5 海藻酸鈉聯合丙二醇（PROH）

海藻酸鈉是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇之后的副產物，其水溶液可在溫和的條件下快速形成凝膠，當有Ca2+等陽離子存在時，可發生離子交換，形成交聯網絡結構，從而形成水凝劑，包裹細胞，在凍存時可以抑制細胞內冰晶的形成[31]。丙二醇其化學性質穩定，毒性小且具有較低的冰點，常用作冷凍保護劑。Huang 等[32]首先使用海藻酸鈉包裹細胞，然后加入丙二醇等作為冷凍保護劑凍存mESC 和hADSC，凍存后發現不管在細胞活性、增殖能力還是功能學上，均與新鮮細胞無顯著性差異，且可以很好地促進細胞的玻璃化凍存以及避免細胞復蘇過程中反玻璃化現象的出現。

5 總結與展望

干細胞具有良好的臨床應用前景，其長期安全穩定保存是一重要問題。冷凍保護劑可有效降低細胞損傷，提高細胞凍存后的活性。經典冷凍保護劑含有DMSO，并不適合臨床使用，安全無毒、無異種抗原的冷凍保護劑是目前研究的主要方向，新型冷凍保護劑的開發對干細胞臨床應用具有重要意義。