枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的工藝研究

■ 管軍軍 張?zhí)煊?高天增 王志祥

（1.河南農業(yè)大學畜牧學博士后科研流動站，河南鄭州450002；2.河南廣安生物科技股份有限公司博士后科研工作分站，河南鄭州450001）

仔豬配合飼料是針對仔豬先天免疫力低、消化系統(tǒng)不健全等生理特性而設計的飼料，但在使用上仍會出現(xiàn)一些問題，如采食量低、生長停滯、腹瀉等情況。研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵飼料對動物的消化與吸收、增強食欲、促進腸道發(fā)育、提高生產性能等方面有顯著影響[1-3]。在發(fā)酵飼料生產中，因成本低，固態(tài)發(fā)酵多被采用。

單菌種發(fā)酵作為固態(tài)發(fā)酵中常見的一種發(fā)酵形式，該發(fā)酵能夠明確菌種的發(fā)酵效果，與混菌發(fā)酵相比，其工藝參數(shù)容易控制，且無菌種間的抑制作用。而且，能夠通過單菌種發(fā)酵研究菌種在發(fā)酵過程中的作用機制。枯草芽孢桿菌作為一種常用于固態(tài)發(fā)酵飼料的菌種，自身蛋白含量較高，可以分泌蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶等多種酶類，迅速降解飼料中大分子蛋白質和抗營養(yǎng)因子，并能提高發(fā)酵飼料中粗蛋白、小肽、維生素和異黃酮苷的含量，從而增強抗氧化能力。現(xiàn)階段，工業(yè)中通常利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕。發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌的大分子降解率較高，且其芽孢耐酸堿、耐高溫，不易致死，可以以活菌的形式進入動物腸道，抑制腸道中有害菌群的生長，促進斷奶豬仔的腸道發(fā)育和養(yǎng)分吸收[4-5]。

但是，有關枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的研究鮮有報道。本課題組結合固態(tài)發(fā)酵飼料的產業(yè)化實際情況，在科學設計試驗方案的基礎上系統(tǒng)地研究枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料生產技術，本研究主要集中在發(fā)酵工藝參數(shù)對發(fā)酵產品主要營養(yǎng)指標（蛋白）的影響及工藝參數(shù)的優(yōu)化，為枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的實際生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

枯草芽孢桿菌BS-GA15購自潤盈生物工程（上海）有限公司，菌種經過篩選馴化后，并加以輔料經冷凍干燥制成發(fā)酵劑（＞108CFU/g），冰箱5℃保存?zhèn)溆谩Ｗ胸i配合飼料551H及552H由河南廣安生物科技股份有限公司生產，其組成如表1所示，另外，葡萄糖等試劑均為分析純，購自鄭州新豐化驗器材有限公司。

1.2 主要儀器設備

SPX-250B智能型生化培養(yǎng)箱，上海瑯玕實驗設備有限公司；JJ-CJ-1FD超凈工作臺，吳江市凈化設備總廠；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；FA2004B電子天平，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 粗蛋白及其增加率的測定

利用凱氏定氮法GB/T6432-1994對仔豬配合飼料或發(fā)酵產品進行粗蛋白的測定，以干基P表示。

蛋白增加率(%)=（P發(fā)酵后-P未發(fā)酵）/P未發(fā)酵×100

1.4 發(fā)酵試驗

將枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑接種到培養(yǎng)液[2%（w/v）仔豬配合飼料551H或552H+2%（w/v）葡萄糖+蒸餾水]中，振蕩均勻，置于30℃條件下振蕩培養(yǎng)，轉速為150 r/min，培養(yǎng)4 h。取發(fā)酵劑活化液一定比例（v/v）接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（由仔豬配合飼料551H或552H與蒸餾水組成，裝料100 g/瓶）上。攪拌均勻后，置于培養(yǎng)箱中固態(tài)發(fā)酵，一定時間后取樣，50℃條件下干燥成品備用。

表1 仔豬配合飼料551H及552H配方

1.5 試驗設計

1.5.1 發(fā)酵時間、固態(tài)培養(yǎng)基組成、發(fā)酵溫度及接種量的影響試驗

試驗主要研究不同的發(fā)酵時間（0、12、16、24、32、40、48 h）、固態(tài)培養(yǎng)基組成[仔豬配合飼料∶水=（80∶20）、（70∶30）、（60∶40）、（50∶50）]、發(fā)酵溫度（25、28、30、32、35 ℃）及接種量（3%、5%、10%、15%、20%）對發(fā)酵產品蛋白含量的影響，其它因素還有培養(yǎng)基的種類（551H與552H），并進行7×2（發(fā)酵時間）、4×2（固態(tài)培養(yǎng)基組成）、5×2（發(fā)酵溫度）及5×2（接種量）試驗設計，每組試驗均重復3次。

1.5.2 優(yōu)化試驗設計——響應面法建模

在研究各種工藝參數(shù)影響的基礎上，根據實際應用及統(tǒng)計分析確定每個因素的最高與最低水平，進行4因素的響應面設計，共27組，每組試驗均重復3次。試驗結果進行二次響應面回歸建模，并預測最佳工藝參數(shù)。

1.5.3 驗證試驗

在優(yōu)化試驗確定最佳理論工藝參數(shù)的基礎上，并對該工藝參數(shù)進行相應的發(fā)酵試驗，其結果與理論值進行差異性比較，最終確定最佳工藝參數(shù)。

1.6 統(tǒng)計方法

利用SAS 9.0軟件對各種工藝參數(shù)影響試驗（7×2（發(fā)酵時間×原料）、4×2（固態(tài)培養(yǎng)基組成×原料）、5×2（發(fā)酵溫度×原料）及5×2（接種量×原料））結果進行雙因素方差分析（ANOVA）、最小二乘法（LSD）進行各水平之間的多重比較（P＜0.05）以及對優(yōu)化試驗進行二次響應面回歸分析。

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵產品蛋白含量的影響

本研究所選用的兩種仔豬配合飼料均為市售產品，551H適合斷奶仔豬，552H適合年齡更大的仔豬，因此在配方上有所側重(表1)，對此我們分別對兩種配合飼料進行枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵研究。通過發(fā)酵時間對發(fā)酵產品的影響可以發(fā)現(xiàn)（見圖1），在0～40 h內，兩種配合飼料均隨著發(fā)酵時間的延長其蛋白含量及其增加率相應提高，達到32 h后，開始下降，趨勢基本一致；但是，當發(fā)酵達到48 h，兩種飼料的蛋白所受的影響不同，551H則出現(xiàn)上漲，而552H則與之相反。而通過統(tǒng)計學分析本次試驗結果，發(fā)酵時間顯著影響著枯草芽孢桿菌對于這兩種飼料固態(tài)發(fā)酵所得產品的蛋白含量（P＜0.000 1)及其增加率（P＜0.000 1），各水平的多重比較排序為：0 hc，12 hbc，16 hbc，24 hb，32 ha，40 ha，48 ha（右上肩標不同字母表示差異顯著P＜0.05），其中發(fā)酵32～48 h后產品中蛋白含量及其增加率顯著高于12～24 h后所得產品（P＜0.05），但是32～48 h內及12～24 h內各水平之間的差異并不顯著（P＞0.05），因此，在后續(xù)優(yōu)化試驗中對于兩種飼料，可確定發(fā)酵時間的最高水平（32 h）及最低水平（12 h）。至于發(fā)酵原料影響，對產品蛋白含量（P＜0.000 1）及其增加率（P=0.000 5＜0.01）的影響非常顯著，且發(fā)酵551H后蛋白的含量及其增加率明顯高于552H（P＜0.05）。

圖1 發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的影響

枯草芽孢桿菌作為一種好氧型微生物，發(fā)酵過程中各種可利用的養(yǎng)分含量勢必影響著其發(fā)酵進程[6]，隨著發(fā)酵時間的延長，培養(yǎng)基中可利用組分逐漸減少，因此，發(fā)酵時間影響著發(fā)酵產品的質量，同時這也控制著發(fā)酵的成本。不過，本研究中，兩種飼料作為固態(tài)發(fā)酵基，因二者飼料配方中存在著差別，導致枯草芽孢桿菌可利用養(yǎng)分有所不同，551H優(yōu)于552H，因此，在發(fā)酵后期，由于552H培養(yǎng)基中可利用養(yǎng)分的匱乏，導致過度發(fā)酵，有機氮轉變?yōu)闊o機氮（氨氣）致使蛋白含量在一定程度上有所減少，由此控制發(fā)酵時間在40 h內可避免枯草芽孢桿菌對于552H飼料的過度發(fā)酵。

2.2 固態(tài)培養(yǎng)基組成對發(fā)酵產品蛋白含量的影響

枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵所采用的固態(tài)培養(yǎng)基由仔豬配合飼料與水組成，那么其中的固液比影響發(fā)酵的進程及相應的生產效率與成本。如圖2所示，兩種培養(yǎng)基中，固液比的大小影響著發(fā)酵產品的蛋白含量及其增加率，但結果二者不同。對于551H固態(tài)培養(yǎng)基，固液比的增加不利于發(fā)酵的進行，低固液比（50∶50）能獲得較高的蛋白含量與增加率；而對于552H培養(yǎng)基，呈現(xiàn)出“U”形分布的特點，即高固液比（80∶20）與低固液比（50∶50）均可獲得較高的產品品質，而處于二者之間的固液比則處于較低水平。但是，本次研究中，固態(tài)培養(yǎng)基組成對于發(fā)酵產品蛋白含量的影響（P=0.027 6＜0.05）及蛋白增加率的影響（P=0.000 8＜0.01）明顯，各水平的多重比較排序：（80∶20）ab，（70∶30）b，（60∶40）b，（50∶50）a（右上肩標不同字母表示差異顯著，P＜0.05），其中，（50∶50）具有較高的蛋白含量及其增加率，含水量降低（70∶30）則不利于枯草芽孢桿菌生長（P＜0.05）。另外，培養(yǎng)基的種類對蛋白含量（P＜0.000 1）及其增加率（P=0.000 8＜0.01)有非常顯著的影響，而且551H發(fā)酵后所得產品的蛋白含量明顯高于552H（P＜0.05），但是552H發(fā)酵后所得產品的蛋白增加率明顯高于551H（P＜0.05）。因此，在后續(xù)優(yōu)化試驗中，結合生產實際，確定固液比最高水平（80∶20=4）及最低水平（50∶50=1）。

圖2 固態(tài)培養(yǎng)基組成對枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的影響

固態(tài)培養(yǎng)基中水分的含量影響著各種微生物養(yǎng)分的溶解與吸收。對于551H，除玉米與豆粕外，含有大量營養(yǎng)成分如乳清粉等（表1），這些成分在水分含量增加的情況下，其溶解性大大提高，有利于枯草芽孢桿菌的吸收利用，因此低固液比（50∶50）有利于該菌種的生長。對于552H，其主要組成除玉米與豆粕外，其余營養(yǎng)組分較少，僅有DDGS，其它如滑石粉、麩皮，不易被微生物利用，可在發(fā)酵過程中調節(jié)透氣性，培養(yǎng)基中水分含量高（低固液比）有利于營養(yǎng)組分的充分溶解，水分含量低（高固液比）有利于氧氣的供給，從而在較高與較低固液比的條件下均利于枯草芽孢桿菌的生長。

2.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵產品蛋白含量的影響

溫度影響著微生物的生長，雖然枯草芽孢桿菌具有一定的耐熱性，但過高的生長溫度易引起環(huán)境中其它雜菌的生長，而對于實際生產，溫度決定著生產過程中的能耗問題。圖3表現(xiàn)了兩種飼料在不同發(fā)酵溫度下其發(fā)酵產品中蛋白含量的變化，而且對不同飼料，其變化趨勢不同。對于551H，30℃較有利于枯草芽孢桿菌的生長，過高或過低均不利于該菌種生長；而對于552H，溫度的影響呈“M”形，28及32℃均有較高的蛋白含量及其增長率。而對所獲得的結果進行統(tǒng)計分析，溫度對該發(fā)酵產品蛋白含量（P=0.046 4＜0.05）及其增加率（P=0.045 2＜0.05)均影響顯著，各水平的多重比較排序為：25℃b、28℃b、30℃a、32℃ab、35℃ab（右上肩標不同字母表示差異顯著P＜0.05），其中，30℃發(fā)酵，551H產品可獲相當高的蛋白含量及其增加率，過低發(fā)酵速度緩慢（P＜0.05），過高則影響不顯著（P＞0.05）。因此，在后續(xù)優(yōu)化試驗中，結合生產實際，對于551H，確定最高發(fā)酵溫度30℃及最低發(fā)酵溫度25℃；而對于552H，確定最高發(fā)酵溫度35℃及最低發(fā)酵溫度25℃。至于發(fā)酵基的種類，在本次試驗中發(fā)現(xiàn)其對于產品蛋白含量（P=0.007 4＜0.01)及其增加率（P＜0.000 1)有顯著的影響，而且551H發(fā)酵后所得產品的蛋白含量顯著高于552H（P＜0.05），但是552H發(fā)酵后所得產品的蛋白增加率明顯高于551H（P＜0.05）。

圖3 發(fā)酵溫度對枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的影響

溫度的提高促進微生物的生命活動，從而加速了培養(yǎng)基中可利用養(yǎng)分的充分利用。前已分析551H中較552H有更多更利于枯草芽孢桿菌利用的營養(yǎng)組分，因此能保持其在較高的溫度(30℃)下快速生長而不過度發(fā)酵，溫度再提高，相同發(fā)酵時間內，由于養(yǎng)分的快速耗盡而發(fā)生過度發(fā)酵，致使蛋白含量下降。而對于552H，相對較為復雜，一方面相對較少的微生物可利用養(yǎng)分及固體顆粒傳質的不連續(xù)性，出現(xiàn)局部過度發(fā)酵；另一方面，固體顆粒之間通透性，氧分能緩慢地補充到微環(huán)境，枯草芽孢桿菌能利用氧分而快速生長；二者相互作用，此消彼長，共同決定著發(fā)酵產品的質量。

2.4 接種量對發(fā)酵產品蛋白含量的影響

接種量決定著培養(yǎng)基中菌種的分布密度，有效的密度可使菌種快速適應環(huán)境并快速生長，過低的接種量整體菌種的分布密度低，菌種間的依存性降低，從而生長適應性及生長速度下降，但是，過高的接種量，雖然有利于菌種的整體分布，但是會增加菌種間對于養(yǎng)分的競爭，不利于菌種健康的生長。如圖4所示，接種量對于枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵這兩種仔豬配合飼料的影響趨勢基本一致。試驗發(fā)現(xiàn)，較低的接種量（3%～5%）更利于枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬飼料，而增加接種量，發(fā)酵產品中蛋白含量及增加率趨于“L”形勢，即下降后趨于穩(wěn)定。統(tǒng)計分析結果表明，接種對發(fā)酵產品中蛋白含量（P=0.000 3＜0.01）及其增加率（P＜0.000 1）的影響非常顯著，各水平的多重比較排序：3%a，5%a，10%b，15%b，20%b（右上肩標不同字母表示差異顯著，P＜0.05），其中，3%～5%的接種量影響最大（P＜0.05），大于10%則各水平之間影響不顯著（P＞0.05）。因此，在后續(xù)優(yōu)化試驗中，結合生產實際，確定接種量最高水平為10%，最低水平為3%。另外，本次試驗中固態(tài)培養(yǎng)基對于產品中蛋白增加率影響顯著（P＜0.000 1），而且是552H培養(yǎng)基中獲得了較高的蛋白增加率（P＜0.05）；不過，培養(yǎng)基的種類對于蛋白含量影響不大（P=0.225 5＞0.05）。

本次試驗結果表明，較低的接種量（3%～5%）的情況下，利用枯草芽孢桿菌對兩種仔豬飼料進行固態(tài)發(fā)酵，均能獲得較好的發(fā)酵效果。由于種子培養(yǎng)液中菌體濃度均達到較高的水平（＞108CPU/ml），接種后具有較高的分布密度，利于菌種快速生長。再增加接種量，雖然菌種能快速生長，但是環(huán)境養(yǎng)分的有限性，傳質的不連續(xù)性，導致微生物競爭性生長加劇，相同發(fā)酵周期內易出現(xiàn)過度發(fā)酵，導致發(fā)酵產品的蛋白含量及其增加率下降。由于551H與552H微生物可利用養(yǎng)分及顆粒間透氣性的差異性，導致了發(fā)酵產品中出現(xiàn)了552H發(fā)酵產品具有較高的蛋白增加率，當然，具體機制仍需要進一步研究。

圖4 接種量對枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的影響

2.5 優(yōu)化試驗

2.5.1 固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料551H(見表2、表3)

在前期確定各種因素的最高與最低水平(發(fā)酵時間12～32 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1～4，發(fā)酵溫度25～30℃，接種量3%～10%)下，進行如表2所示的響應面試驗。通過對該試驗結果統(tǒng)計分析（表3）發(fā)現(xiàn)，在所構造的二次模型中，一次項t、R、T、I及二次項T×T、I×I、R×R及模型整體均較為顯著（P＜0.01），且模型的失擬項（P＞0.05）不顯著，該模型可在各因素的水平范圍內應用于枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料551H工藝。通過擬合并估計出二次響應面回歸模型各顯著項的系數(shù)，并進行蛋白含量及增加率最高時的最佳工藝參數(shù)預測，其結果為：發(fā)酵時間32 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1，發(fā)酵溫度30℃，接種量4.75%，此時有較高的蛋白含量（22.78%）及其增加率（9.03%）。

表3 枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料551H優(yōu)化試驗統(tǒng)計分析結果

2.5.2 固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料552H

在前期確定各種因素的最高與最低水平(發(fā)酵時間12～32 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1～4，發(fā)酵溫度25～35℃，接種量3%～10%)下，進行如表4所示的響應面試驗。通過對該試驗結果統(tǒng)計分析（表5）發(fā)現(xiàn)，在所構造的二次模型中，一次項t、R、T、I及二次項t×t、T×T、I×I、R×R及模型整體均較為顯著（P＜0.01），且模型的失擬項（P＞0.05）不顯著，該模型可在各因素的水平范圍內應用于枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料552H工藝。通過擬合并估計出二次響應面回歸模型各顯著項的系數(shù)，并進行蛋白含量及增加率最高時的最佳工藝參數(shù)預測，其結果為：發(fā)酵時間32 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值4，發(fā)酵溫度35℃，接種量4.75%，此時有較高的蛋白含量（22.07%）及其增加率（14.48%）。

表4 枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料552H響應面設計與結果

表5 枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料552H優(yōu)化試驗統(tǒng)計分析結果

2.5.3 驗證試驗

為了進一步檢驗經過響應面設計試驗所獲得的模型及其預測的最佳工藝條件的可靠性，在最佳工藝條件下進行驗證試驗，并重復5次，結果及統(tǒng)計分析如表6所示：對于枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵551H及552H，驗證試驗結果與預測結果差異性均不顯著（P＞0.05）,因此，模型預測的最佳工藝參數(shù)適合實際應用。

表6 驗證試驗及統(tǒng)計分析結果

3 結論

對于枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料551H及552H的發(fā)酵時間、固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值、發(fā)酵溫度、接種量等工藝參數(shù)進行了系統(tǒng)地研究，得到如下結論：

①在前期各因素對于固態(tài)發(fā)酵的影響試驗中，發(fā)酵時間、固態(tài)培養(yǎng)基組成、發(fā)酵溫度、接種量以及固態(tài)培養(yǎng)基的種類顯著影響著枯草芽孢桿菌對于這兩種飼料固態(tài)發(fā)酵產品的蛋白含量及其增加率。

②對于固態(tài)發(fā)酵551H，確定各種因素的最高與最低水平為發(fā)酵時間12～32 h、固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1～4、發(fā)酵溫度25～30 ℃、接種量3%～10%；對于固態(tài)發(fā)酵552H，確定各種因素的最高與最低水平為發(fā)酵時間12～32 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1～4，發(fā)酵溫度25～35℃，接種量3%～10%。

③通過響應面試驗設計統(tǒng)計分析得到可靠性較高的二次響應面回歸模型，并預測最佳工藝參數(shù)：對于固態(tài)發(fā)酵551H，發(fā)酵時間32 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值1，發(fā)酵溫度30℃，接種量4.75%；對于固態(tài)發(fā)酵552H，發(fā)酵時間32 h，固態(tài)培養(yǎng)基組成/固液比值4，發(fā)酵溫度35℃，接種量4.75%。驗證試驗證明該參數(shù)可行。

因此，該研究結果將為工業(yè)化枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的工藝提供試驗與理論支撐，但是仍需要進行放大試驗、中試等進一步研究，以更好地應用實際生產。