響應面法優(yōu)化大曲中黃曲霉毒素B1提取工藝

張崇軍，唐賢華*，趙 龍，朱克永，周 文，隋 明，舒學香

（1.四川工商職業(yè)技術學院，四川 都江堰 611830；2.成都市華測檢測技術有限公司，四川 成都 610041）

黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）主要是指由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產生的一類有毒的次生代謝產物，廣泛存在于農作物及食物中，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）的癌癥研究機構劃定為“Ⅰ”類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質，對人及動物肝臟組織具有破壞作用，嚴重時可導致肝癌甚至造成機體死亡[1-4]。目前，分離得到的AFT及其衍生物已有20多種，其中毒性和致癌性最大的是黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）[5-7]。主要危害包括對人體細胞的致癌作用、細胞毒性、對免疫系統(tǒng)的損害、肝臟細胞的毒性等。由于黃曲霉毒素對水稻、玉米、小麥等糧食作物有著很強的侵染性[8]，且大曲主要是以小麥、大麥、豌豆等糧食作物為原料，故大曲存在黃曲霉毒素污染的可能性[9]。近年來白酒安全問題不斷涌現，俗話說“曲為酒之骨”[10]，因此做好大曲生產過程中黃曲霉素的檢測對確保白酒質量安全，保障消費者健康很有必要。

目前關于黃曲霉毒素B1的提取方法主要包括超聲波處理、振蕩、微波處理、均質和紫外線輻射等，林耀盛等[11]采用微波處理的方法提取米糠中的黃曲霉毒素B1，取得了較好的效果；王洪健等[12]采用紫外輻照處理來提取花生油中黃曲霉毒素B1；龔珊等[13]為了測定玉米中黃曲霉毒素B1，對超聲、振蕩、高速均質3種樣品前處理提取方法的提取效果進行了比較分析；畢春元等[14-15]選擇了超聲波處理的方法分別對花生和蠶豆中的黃曲霉毒素B1進行了提取和工藝參數的優(yōu)化，為黃曲霉毒素B1的檢測提供了可靠的方法。為了加強大曲中黃曲霉毒素的溶解度和擴散，有利于毒素的提取完全，綜合安全和經濟性等方面的考慮，本研究采用超聲波處理從大曲中提取黃曲霉毒素B1，結合Plackett-Burman試驗設計和響應面分析法優(yōu)化提取條件以建立最適的提取方案來確立有效和準確的檢測參數，為提高大曲安全性，進一步保障濃香型白酒的生產安全奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

中高溫大曲：取自川南某制曲廠，貯存期為30d，取樣后密封保存。

1.1.2 試劑

甲醇、二氯甲烷、無水硫酸鈉（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；酶聯免疫試劑盒（96孔/48孔）：北京華安麥科生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

F50型酶標儀：瑞士Tecan公司；SB-5200DTD型超聲波提取儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；DZKW-S-8型電熱恒溫水浴鍋：北京市光明醫(yī)療儀器有限公司；SORVALL Stratos型高速離心機：美國Thermo公司；φ15 cm快速定性濾紙：泰州市奧克濾紙廠。

1.3 方法

1.3.1 大曲中AFB1的提取[16]

準確稱取粉碎混勻的大曲樣品10.00g，通過20目篩，置于250 mL具塞錐形瓶中，分別加入80 mL不同體積分數的甲醇-水溶液，在不同的溫度條件下，采用不同的超聲波功率提取不同的時間后，用快速定性濾紙過濾于錐形瓶中。吸取10 mL濾液于分液漏斗中，加入40 mL二氯甲烷，加塞振搖5 min，靜置分層（約30 min），棄下層相，再加入10 mL二氯甲烷于分液漏斗中，重復提取，合并二氯甲烷相，經盛有約20 g預先用二氯甲烷潤濕的無水Na2SO4濾紙漏斗過濾于錐形瓶中，以65℃水浴烘干，冷卻后加入10 mL體積比為1∶1的甲醇-水溶液，即為待測樣品。

1.3.2 AFB1的檢測

按照參考文獻[17]中酶聯免疫法檢測大曲中AFB1的含量。

1.3.3 AFB1提取工藝優(yōu)化單因素試驗

根據1.3.1，初始超聲功率為200 W、超聲時間為20 min、超聲溫度為30℃。采用單因素輪換法，依次考察甲醇溶液體積分數（45%、55%、65%、75%、85%）、超聲功率（140 W、160 W、180 W、200 W、220 W）、提取時間（15 min、20 min、25 min、30min、35min）、提取溫度（20℃、30℃、40℃、50 ℃、60℃）4個因素對大曲中AFB1提取率的影響。采用酶聯免疫法測定AFB1濃度，平行試驗3次，確定最佳提取工藝條件。

1.3.4 AFB1提取工藝優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，采用4因素3水平的Box-Behnken響應面試驗設計法[14-18]，以甲醇溶液體積分數（A）、超聲波功率（B）、提取時間（C）和提取溫度（D）為考察因素，以黃曲霉毒素B1的得率（Y）為評價指標，優(yōu)化大曲中AFB1的提取工藝。

1.3.5 數據統(tǒng)計與分析

運用Design-Exper（tVersion 8.0.6）軟件對數據進行回歸擬合，作出響應曲面圖，并進行線性回歸和方差分析。

2 結果與分析

2.1 AFB1提取工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 甲醇溶液體積分數對AFB1提取效果的影響

甲醇溶液體積分數對大曲中AFB1的提取效果的影響見圖1。

圖1 甲醇溶液的體積分數對黃曲霉毒素B1提取效果的影響Fig.1 Effect of methanol solution volume fraction on the extraction effect of aflatoxin B1

由圖1可知，不同體積分數的甲醇溶液對AFB1提取效果影響較大，隨著甲醇溶液體積分數的提高，AFB1得率不斷增大，當甲醇溶液的體積分數為55%時，AFB1的得率達到最大值，為2.27 μg/kg，之后又逐漸下降，出現這種現象的原因可能是隨著料液比的增加，固液接觸面積和濃度梯度增加，有利于大曲中的AFB1內向外擴散，使得AFB1得率增加。當料液比繼續(xù)增加，醇溶性的雜質溶解度增加，使AFB1的溶解被抑制，因此確定甲醇溶液的最佳體積分數為55%。

2.1.2 超聲波功率對AFB1提取效果的影響

超聲波功率對大曲中AFB1的提取效果的影響結果見圖2。

圖2 超聲波功率對黃曲霉毒素B1提取效果的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction effect of aflatoxin B1

由圖2可知，當超聲波功率范圍為140～200W時，AFB1得率隨著超聲波功率的增大不斷增加，說明黃曲霉毒素的提取率在不斷提高；當超聲波功率為200 W時，AFB1的得率達到最大值，為2.33 μg/kg，繼續(xù)升高超聲波功率，AFB1得率逐漸降低，分析原因可能是隨著超聲波頻率增大，溫度升高，有利于大曲中其他醇溶性雜質的溶出，影響黃曲霉毒素B1的測定。因此，綜合考慮確定最適超聲波功率為200 W。

2.1.3 提取時間對AFB1提取效果的影響

提取時間對大曲中AFB1的提取效果的影響結果見圖3。

圖3 提取時間對黃曲霉毒素B1提取效果的影響Fig.3 Effect of the extraction time on the extraction effect of aflatoxin B1

由圖3可知，提取時間為15～25 min時，AFB1得率隨提取時間的延長增長速率較快；當提取時間為25 min時，AFB1的得率達到最大值，為2.58 μg/kg，分析原因可能是由于黃曲霉毒素在甲醇/水溶液中的溶解度隨著時間的延長而增大，同時由于萃取過程中溫度升高，提取液黏度減少，擴散系數增加，促使提取速度加快。提取時間過度延長，使得提取溫度過高，雜質的溶出量增加，使黃曲霉毒素的檢測受到干擾，另一方面成本費用增大，造成溶劑損失，影響環(huán)保。綜合各方面因素考慮，確定黃曲霉毒素B1的最佳提取時間為25 min。

2.1.4 提取溫度對AFB1提取效果的影響

提取溫度對大曲中AFB1的提取效果的影響結果見圖4。

圖4 提取溫度對黃曲霉毒素B1提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction effect of the aflatoxin B1

由圖4可知，提取溫度為20～30℃時，AFB1得率隨提取溫度的升高逐漸提高；當提取溫度為30℃時，AFB1得率達到最大值2.43 μg/kg，提取溫度再增加，AFB1得率呈緩慢下降的趨勢，這是因為溫度升高后使AFB1結構發(fā)生改變，同時雜質的浸出量也增加，從而影響了提取效果。因此，確定黃曲霉毒素B1的最適提取溫度為30℃。

2.2 AFB1提取工藝優(yōu)化響應面試驗

2.2.1 響應面分析試驗設計方案

在單因素試驗的基礎上，選取甲醇溶液體積分數（A）、超聲波功率（B）、提取時間（C）、提取溫度（D），以黃曲霉毒素B1得率（Y）為響應值。利用Minitab軟件進行Box-Behnken試驗設計[18]，其因素與水平見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 AFB1提取工藝優(yōu)化響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for AFB1 extraction process optimization

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

2.2.2 回歸方程的建立及顯著性分析

利用Design-Expert8.06軟件對試驗結果進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸模型方程：

對該模型進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

由表3可知，回歸方程模型P值為0.000 1＜0.01，表明該方程擬合度較好。失擬項P值為0.219＞0.05，表明失擬項不顯著，模型不失擬，選擇合理。該模型的相關系數R2=0.9406，說明該模型能解釋94.06%響應值的變化，校正決定系數R2adj=0.871 3，說明該模型擬合程度較好[19]，試驗誤差較小，因此可用此模型對大曲中AFB1的提取工藝條件進行分析和預測。

根據回歸方程一次項系數絕對值的大小，可知影響大曲中AFB1提取效果的主次因素為B（超聲波功率）＞A（甲醇溶液體積分數）=D（提取溫度）＞C（提取時間）[20]。模型的一次項A、B、C、D對結果影響均不顯著（P＞0.05）；二次項A2、B2、D2、C2對結果影響均極顯著（P＜0.01）；交叉項AB、AC、BC對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響均不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 AFB1提取工藝優(yōu)化響應面分析

各個因素間的交互作用對大曲中AFB1提取效果影響的響應曲面圖及其等高線圖見圖5。

等高線的形狀反映出交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反[21]。由圖5可知，甲醇溶液體積分數、超聲波功率、提取時間和提取溫度間的交互作用對大曲中AFB1提取效果的影響均出現拋物面型關系，所得到的響應面都存在一個極大值點，其中甲醇溶液體積分數、超聲波功率、提取時間分別與提取溫度的交互作用等高線呈橢圓形，對結果影響顯著（P＜0.05）。

圖5 甲醇溶液體積分數、超聲波功率、提取時間和提取溫度對AFB1提取效果影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interactions between methanol solution volume fraction,ultrasonic power,extraction time and temperature on the extraction effect of AFB1

經過響應面優(yōu)化，根據擬合二階模型公式得到理論上大曲中黃曲霉毒素B1的最佳提取工藝條件為甲醇溶液體積分數54.91%，超聲波功率199.44 W，提取時間24.86 min，提取溫度29.83℃，在此最優(yōu)條件下，AFB1得率的理論值為2.59 μg/kg。考慮到實際操作的可行性，將上述最優(yōu)條件修訂為甲醇溶液體積分數55%，超聲波功率200 W，提取時間25 min，提取溫度為30℃。

2.2.4 驗證試驗

為了驗證該模型的有效性及實用性，在此最佳提取條件下對該模型做3次驗證試驗，結果測得AFB1得率為2.58 μg/kg，與預測結果基本一致，因此，該模型能較好地預測實際AFB1的提取狀況。

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上，選取甲醇溶液體積分數、超聲波功率、提取時間和提取溫度4個因素，利用Design-Expert8.0.6軟件進行4因素3水平的Box-Behnken中心組合設計，通過響應面優(yōu)化得到大曲中AFB1的最佳提取工藝條件：甲醇溶液體積分數55%，超聲波功率200 W，提取時間25min，提取溫度為30℃。在此最優(yōu)條件下，大曲中AFB1的得率為2.58 μg/kg。