核-殼型松香基磁性聚合物固定化脂肪酶的制備及性能

黎克純，雷福厚，2，盧建芳，2*，周菊英，2，許海棠，2，趙彥芝，2

（1.廣西民族大學 化學化工學院，廣西 南寧 530006；2.廣西民族大學 廣西林產化學與工程重點實驗室，廣西 南寧 530006）

脂肪酶作為一種特殊的生物催化劑，既可以促進油脂的水解，又可以在一定的條件下加速油脂的合成，發生酯交換反應[1-2]。鑒于以上特點，廣泛應用于食品、醫藥、工業等領域。但游離酶在使用過程中局限性較大（如成本高、難回收、易失活、重復使用率低），使酶的應用提出較大挑戰，固定化酶技術的提出，提高了酶的催化性能、操作穩定性和重復利用率，并降低了生產成本，為酶提供了廣闊的應用前景[3-5]。

磁性復合材料既具有功能化基團，又具有良好的磁導向性，可以結合多種生物分子，且通過外加磁場快速進行分離和回收。因此被廣泛應用制備固定化脂肪酶領域[6-9]。

本研究以天然產物松香的衍生物為交聯劑，采用共沉淀法及懸浮聚合法制備出具有磁性的核-殼結構的球狀聚合物，用化學交聯法固定脂肪酶。優化了載體的制備及酶固定化條件，表征了核-殼型松香基磁性微球的結構和考察了酶學性質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬來松香乙二醇丙烯酸酯：本實驗室自制；甲基丙烯酸、丙烯酸、戊二醛、氫氧化鈉、無水乙醇、十二水合磷酸二鈉、磷酸二氫鉀等（均為分析純）：天津大茂化學試劑廠；脂肪酶（生物試劑），聚乙烯醇、橄欖油、二氯亞砜（均為分析純）：國藥集團化學試劑公司；所有溶液均使用高純水配制。

1.2 儀器與設備

SYC-15超級恒溫水浴鍋：南京桑力電子設備廠；Scientz-10N冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；ZJ-2B磁天平：南京多助科技發展有限公司；ASAO2010微孔分析儀：美國麥克micromertics公司；SUPRA55Sapphire場發射掃描電子顯微鏡：德國卡爾蔡司（carlZEISS）公司；D8Advance型x射線衍射儀：德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 具有菲環結構的高分子磁性微球的制備

取甲基丙烯酸4.2 g、丙烯酸1.8 g和馬來松香丙烯酸乙二醇酯20.0 g，溶于50 mL乙酸乙酯后再加入過氧化二苯甲酰0.06g，超聲20min后再加入FeCl3·6H2O3.2g、FeCl2·4H2O 1.4 g及蒸餾水100 mL，繼續超聲30 min，然后400 r/min攪拌，緩慢加熱至80℃，迅速加入25 mL質量分數25%的氨水再保溫6 h。通過外加磁場分離出磁性微球，并用無水乙醇和去離子水反復洗滌。

取上述固體5 g加入5 mL吡啶中，冰浴條件下緩慢滴加15mL二氯亞砜，反應4h后減壓抽濾。再向其中加入溶有5 mL乙二胺的10 mL 1.4-二氧六環的溶液。常溫條件下，磁力攪拌反應2 h，在外加磁場的作用下固液分離并用蒸餾水反復洗滌。

1.3.2 松香基載體性能與結構的測試

傅里葉變換紅外光譜學（Fouriertransforminfrared，FT-IR）分析：樣品與標準溴化鉀固體按質量比為1∶200進行混合，壓片后進行測試，分析樣品所含官能團。

孔徑分析：采用微孔分析儀，低溫條件下氮氣吸/脫附，測試磁性微球的比表面積、孔體積及平均孔徑。

X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）分析：采用x射線衍射儀對樣品進行物相分析。使用Cu-Kα作為輻射源，采用步進掃描，掃描范圍2θ為10～80°，步長為0.013，掃描速率為5°/min。

掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）分析：采用場發射掃描電鏡，觀測磁性微球的外部及內部的形貌。

磁化率：按照參考文獻[10]測定磁化率：采用古埃及磁天平測定松香基磁性微球在磁場強度為400 mT的磁化率。以莫爾鹽為基準物質，計算公式為：

式中：M樣、M標分別為待測樣品和標準樣品的質量，g；ΔM樣、ΔM標分別為待測樣品和標準樣品施加外加磁場的質量差。M標=37.3 mg，M樣=35.6 mg。

1.3.3 固定化脂肪酶的制備方法

稱取1.0 g脂肪酶粉末，放入50 mL的磷酸鹽緩沖溶液（pH7.5）中，加入磁性松香基微球（載體與酶的質量比從1∶0.5～1∶5.0），磁力攪拌條件下，加入體積分數50%的戊二醛（加入量為總體積的0.1%～2.7%），冰浴條件下，反應0.5～4 h，在外加磁場的作用下固液分離并用蒸餾水反復洗滌，將制得的固定化酶冷凍干燥。

1.3.4 酶學性質的測定

最適溫度和pH：分別將固定化酶和游離酶置于20～70℃水浴中和pH值為5.8～8.0緩沖溶液中按照1.3.5進行酶活檢測。

熱穩定性：分別將固定化酶和游離酶置于50℃水浴中，每隔30 min測其活力，考察載體固定化技術能否提高酶的耐熱性能。

儲存穩定性：將固定化酶與游離酶同時放在4℃的冰箱保存，每隔一段時間測定一次活力，以最高的酶活為100%。

操作穩定性：將固定化酶置于45℃，pH 7.0的底物中，按1.3.5進行酶活測定。每次催化完成后，回收固定化酶，用于下一次反應：把第一次使用時酶活定義為100%。考察固定化酶在催化反應中的重復使用性。

1.3.5 測定方法

按照參考文獻[11]測定酶的活性。

2 結果與分析

2.1 核-殼型松香基磁性球狀聚合物的制備

各反應條件對磁含量的影響見圖1。

由圖1a可知，形成聚合物的磁含量隨著反應溫度的升高呈先增大后減小的趨勢，在反應溫度為75℃時，磁含量最高為20.35%。可能是因為此反應為自由基聚合，引發劑受熱裂解產生自由基，溫度越高產生的自由基越多。當自由基少時，不易在磁核周圍發生聚合，難形成核-殼型磁性聚合物；當自由基多時，Fe3O4周圍的自由基不斷發生碰撞，易形成大顆粒，含磁量較少。因此選擇反應溫度為75℃為宜。

由圖1b可知，形成聚合物的磁含量隨引發劑用量的增加呈先增大后減小的趨勢，當引發劑用量為單體總質量的1%時，形成的聚合物磁含量最高為21.52%。可能是因為隨著引發劑用量增加，溶液中的自由基濃度逐漸增加，Fe3O4經歷了從不易被包覆，到易于被分子質量較低的高分子包覆，最后到分子質量較高的高分子包覆的過程。因此選擇引發劑用量為1%為宜。

由圖1c可知，隨著水油比的增加呈先增大后減少的趨勢，當水油體積比為2∶1時，形成的聚合物磁含量最高為21.87%。可能是因為引發劑（過氧化二苯甲酰）屬于油溶性引發劑，在不斷的攪拌下，含有引發劑的油滴分散在水中，形成水包油。引發劑裂解產生的自由基，與油水界面的單體發生自由基傳遞，從而形成聚合物。隨著水量的增加，油滴可以均勻的分散在水中，與水中單體及Fe3O4的接觸機會增加，易形成含磁量高的聚合物。當繼續加大水量，相當于稀釋引發劑、單體及Fe3O4的濃度，因此合成的聚合物磁量逐漸減少。因此選擇水油體積比為2∶1為宜。

由圖1d可知，形成聚合物的磁含量隨著轉速的增加呈先增大后減小的趨勢，當轉速為450 r/min時，聚合物的磁含量最高為22.23%。可能是因為當加大攪拌速度時，相當于加快自由基相對運動，增加Fe3O4面自由基碰撞聚合的機會，易合成含磁量較高的高分子。當攪拌速度繼續增大，剪切力逐漸增強，含有表引發劑的液體形成更多更小的小液滴，分散在溶液中，能產生更多的自由基，自由基之間更易于聚合，可能形成的聚合物未包覆上Fe3O4（只有在Fe3O4表面的自由基發生聚合，才易得到磁性高分子）含磁量減小。因此選擇轉速為450 r/min為宜。

由圖1e可知，形成聚合物的磁含量隨著聚合反應時間的延長呈先增大后減小的趨勢，當聚合反應時間為4 h時，最佳磁含量為23.32%。可能是因為整個反應的過程就是自由基在Fe3O4表面不斷聚合，把Fe3O4包覆在高分子內。隨著反應時間的增加，不斷有自由基碰撞包覆在Fe3O4的外層，形成較大的顆粒，Fe3O4外層被分子量較高的松香基高分子包覆，磁含量相對減小。因此選擇聚合反應時間4h為宜。

圖1 反應條件對磁含量的影響Fig.1 Effect of reaction condition on magnetic content

2.2 松香基載體性能與結構

2.2.1 FT-IR分析

圖2 松香基磁性微球的傅里葉變換紅外譜圖Fig.2 FTIR spectra of rosinyl magnetic microspheres

由圖2可知，580 cm-1為Fe-O的伸縮振動，說明Fe3O4包裹在松香基微球里，形成核-殼結構[12]；1 724 cm-1出現了吸收峰為酰胺基的C=O的伸縮振動，3 374 cm-1為N-H的伸縮振動，1 644 cm-1、1 448 cm-1為C-N伸縮振動，以上均表明該核-殼型松香基磁性微球含有-CO-NH-基團[13]；1 167 cm-1為C-N伸縮振動，1 552 cm-1為N-H彎曲振動，說明該改性核-殼型松香基磁性微球含有-NH2基團[14]。

2.2.2 孔結構分析

采用靜態氮氣吸附法在低溫條件下測定磁性微球（2.5～4 mm）的比表面積、孔體積及平均孔徑，分別為23.36 m2/g、0.427 cm3/g和18.574 nm。

2.2.3 XRD分析

具有菲環骨架的高分子磁性微球的XRD圖譜如3圖所示。

由圖3可知，2θ=30.18、35.49、43.11、56.90、62.58處的衍射峰，分別屬于Fe3O4的（220）（311）（400）（511）（440）晶面的衍射，與Fe3O4的標準卡（JCPDS NO.74-0748）結果基本相符[15]。

圖3 松香磁性微球的XRD圖譜Fig.3 XRD spectra of the rosinyl magnetic microspheres

2.2.4 SEM分析

圖4 松香基磁性微球的電鏡圖Fig.4 SEM images of the rosinyl magnetic microspheres

由圖4a可知，磁性微球表面有大量大小不一的孔洞，脂肪酶和戊二醛可以通過孔洞進入，與微球內部的官能團結合。由圖4b可知，微球剖面圖內部有大量空腔，比較蓬松，增大了微球內部的表面積，有利于固定在微球孔道內部的酶與底物接觸發生反應。

2.2.5 磁化率測定[10]

表1 松香基磁性微球磁化結果Table 1 Magnetic structure of rosinyl magnetic microspheres

由表1可知，產品磁化率為5.375×10-4cm3/g，在10-5～10-3之間，說明產品具有順磁性[16]。

2.3 優化固定條件

本固定化方法是利用戊二醛兩端的-CHO基與載體和脂肪酶的-NH2基發生交聯反應，將酶固定在載體上。交聯條件對固定化酶活力的影響結果見圖5。

圖5 交聯條件對固定化酶活力的影響Fig.5 Effect of crosslinking conditions on activity of immobilizedlipase

由圖5a可知，隨著交聯劑（戊二醛）濃度的增加，酶活回收率呈先增大后減小的趨勢。當戊二醛濃度為1.5%時，所得固定化酶活性最高。可能是因為交聯劑濃度較低時，游離酶分子不能完全固定在載體上，制備的固定化酶活力不高。但是隨著交聯劑濃度的增大，過多的戊二醛分子與固定化酶的酶分子活性中心發生交聯，從而降低酶的活力[17]。

由圖5b可知，隨著交聯時間的延長，酶活回收率呈先增大后減小的趨勢。交聯時間為1 h時酶活回收率達最大值。當固定化時間太短，酶沒有完全結合在載體上，固定化酶活力小。戊二醛即是一種交聯劑又是一種變性劑，長時間與酶接觸，戊二醛有更多機會破壞起催化作用的酶的活性中心，使部分酶失去活性[18]。同時，當過多的酶擁擠在載體的孔道內，阻礙了與底物的接觸，導致固定化酶活性低。

由圖5c可知，隨著酶與載體質量比的增加，酶活回收率呈先增大后減小的趨勢。當酶與載體的質量比為2∶1時，酶活回收率最大為86.17%。當有過多的酶固定在載體表面或是孔道內部，由于酶分子間的空間位阻的關系，導致有部分酶的活性中心與底物不能充分接觸。酶的有效利用率低，不經濟環保。

2.4 酶學性質

2.4.1 最適溫度和pH

圖6 固定化酶和游離酶的最適溫度（a）和pH（b）Fig.6 Optimum temperature(a)and pH(b)of immobilized lipase and free lipase

由圖6可知，相比游離脂肪酶，固定化酶的最適溫度提高了約5℃。可能是載體的剛性結構保護了酶分子結構，故固定化酶的耐熱性提高[19]。與游離酶相比，固定酶的最適pH值向堿性方向移動0.5個單位。可能是由于固定化酶的氨基影響，使固定化酶周圍產生濃度梯度導致固定化酶的最適pH值發生移動[20]。

2.4.2 熱穩定性

圖7 固定化酶和游離酶的熱穩定性Fig.7 Thermal stability of immobilized lipase and free lipase

酶分子固定在具有剛性結構的磁性松香基載體上，有利于保護酶分子的三維結構，增強酶的剛性，減少其受外界條件的影響。游離酶在50℃保溫，酶活力下降明顯，240 min后，殘余活力僅為最初的7.15%。而固定酶在50℃保溫，其活力下降緩慢，240min后，活力仍為原來的72.56%，可見固定酶具有更好的熱穩定性。

2.4.3 儲存穩定性

圖8 固定化酶和游離酶的儲存穩定性Fig.8 Storage stability of immobilized lipase and free lipase

由圖8可知，游離酶的活性下降很快，而固定化酶存儲3個月，活性仍保持在85%左右，說明固定化后脂肪酶的存放能力明顯提高。可能原因是：（1）用交聯劑（戊二醛）將脂肪酶分子固定在載體上，可防止酶分子伸展變性[21]；（2）載體的剛性結構保護了酶分子的三維結構，減少外界不利因素對酶結構的破壞。

2.4.4 固定化酶的穩定性

圖9 固定化酶的操作穩定性Fig.9 Operation stability of immobilized lipase

以核-殼型松香基磁性微球為載體的固定化酶重要的應用優勢就是可利用外加磁場快速將固定化酶從反應媒介中分離回收，再利用。可以簡化后續操作工藝，降低損耗費用，減少環境污染。由圖9可知，連續循環7個批次，其相對酶活力仍保持73.52%。

3 結論

在水油體積比為2∶1，加入單體總質量1%的引發劑（過氧化二苯甲酰），轉速450 r/min，反應溫度為75℃時，聚合4 h，制備出核-殼型松香基磁性微球。

核-殼型松香基磁性微球為載體，交聯法制備固定化脂肪酶。50%的戊二醛（交聯劑）用量為1.5%（總體積）；交聯4 h；酶與載體的質量比為2∶1制得的固定化酶最大酶活回收率為86.17%。

固定化脂肪酶的最適溫度及pH值分別為45℃、7.0；比游離酶提高了約5℃，向堿性方向移動0.5個單位；50℃保溫4 h，固定化酶酶活力保留72.56%，而游離酶只有7.15%，說明酶固定在松香基磁性載體上熱穩定性提高；儲存穩定性及操作穩定性均有所提高。

可利用磁性快速從反應媒介中回收，再利用，可以簡化后續操作工藝，降低損耗費用，減少環境污染。此方法可以作為一種通用方法，開發各種基于多孔松香基磁性載體的固定化酶。