一株海洋鏈霉菌發酵條件的優化及其抑菌活性物質的研究

梁光杰，車程川，鞏志金，楊 革*

（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜 273165）

放線菌（Streptomycessp.）屬于革蘭氏陽性菌，能夠產生具有經濟意義的次級代謝產物和其他具有藥物意義的化合物，當前發現的70%天然抗生素產自放線菌[1]，因此被認為是重要的微生物[2-4]。近幾十年來，從陸地分離到大量放線菌菌株[5-7]，但是從陸地上發現新的放線菌菌株以及新穎的化合物變得越來越困難，所以人們把目光轉向海洋。海洋放線菌需要適應極端的海洋環境，所以形成了不同于陸生放線菌的獨特、復雜的代謝途徑。因此產生的次級代謝產物在結構類型和生物活性方面呈現出多樣性和新穎性[8]。ZOBELL C E[9]研究發現，海水具有殺菌的能力，隨后世界各國加大對海洋微生物資源開發的力度。研究發現，大約27%種屬的海洋微生物次級代謝產物具有抗菌活性的潛力[10]，其中放線菌的活性次級代謝產物約占微生物來源的活性次級代謝產物的45%，海洋放線菌次級代謝產物的開發和研究為生產新的抗生素開創了新的途徑[11]。微囊化技術、噬菌體定向篩選等新技術廣泛的應用使海洋放線菌研究得到飛速的進展[12]。目前為止，對海洋放線菌及其次級代謝產物研究報道很多[13-16]。這些新化合物具有新穎的結構、良好的生物活性，如抑制腫瘤生長[17]、抑制真菌生長[18]、拮抗瘧疾[19]以及殺蟲的潛力[20-21]。因此，從海洋環境中分離純化放線菌，對研究海洋放線菌種類的多樣性及其次級代謝活性物質具有重大意義[22]。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、產氣桿菌（Aerobacter aerogenes）和變形桿菌（Proteus）是常見的致病菌。因此選擇這3種廣泛存在菌株作為指示菌用于海洋放線菌的篩選，以達到尋找新型海洋抗生素的目的。

海洋灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens）F8由本實驗室分離于日照海岸線，通過研究影響其抑菌活性的培養條件，優化了其發酵條件。通過探究其發酵產物的性質并對抑菌活性物質進行了粗提，并對粗提物進行了最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的探究，為以后抑菌活性物質進一步的分離純化奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens）F8：由本實驗室分離鑒定并保存到中國微生物菌種保藏管理中心，專利菌種保藏專利號為CGMCC NO.14923。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923、產氣桿菌（Aerobacter aerogenes）CGMCC 1.183、變形桿菌（Proteus）CGMCC 1.491：均為本實驗保存。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖、可溶性淀粉、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、七水硫酸亞鐵、七水硫酸鎂（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；麥芽浸粉（生化試劑）：大連美侖生物技術有限公司；AB-8大孔吸附樹脂：天津市光復精細化工研究所；鈉型732陽離子交換樹脂：北京索萊寶科技有限公司；葡聚糖凝膠G25：美國GE公司。

1.1.3 培養基

菌株F8活化培養基采用麥芽浸粉（yeast extract-malt extract-glucose，YMG）培養基：酵母浸粉4 g，葡萄糖4 g，麥芽浸粉10 g，自然海水1 L，pH 7.0～7.5，115 ℃滅菌30 min。

菌株F8發酵培養基采用高氏一號培養基：可溶性淀粉20g，KNO31 g，KH2PO40.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，自然海水1 L，121 ℃滅菌20 min。

指示菌生長培養基采用LB培養基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，蒸餾水1 L，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

DK-8D電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設備有限公司；PHS-3CpH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；GNP-9080型隔水式恒溫培養箱；Lab-Therm LT-X振蕩培養箱：比歐科技國際發展有限公司；HP PLUS 10D全自動蛋白純化系統：利穗科技（蘇州）有限公司；1-14小型臺式離心機、3-18KS高速冷凍離心機：美國Sigma公司；Alpha 1-2LD plus冷凍干燥機：德國CHRIST公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

將菌株F8從甘油管中取出，接種于固體YMG培養基中，于恒溫培養箱中28℃條件下培養7 d。

1.3.2 種子液的制備

將活化好的菌株接種于液體高氏一號培養基中180r/min、28℃條件下搖床培養2 d。

1.3.3 抑菌活性的測定

將菌株F8進行發酵（初始pH值7，28℃條件下搖瓶發酵7 d），然后發酵液10 000 r/min離心10 min，取上清進行抑菌活性測試。使用牛津杯法測定抑菌活性：吸取0.2mL指示菌菌液到LB平板表面，用涂布棒將菌液涂布均勻，在培養基表面垂直擺放牛津杯（內徑6 mm），輕輕安放，使其與培養基接觸無空隙，在杯中加入0.2mL發酵液。然后將平板于37℃條件下培養24h，之后測量透明圈直徑（透明圈＞6mm，說明具有抑菌作用）。

1.3.4 發酵條件的優化

培養時間對菌株F8抑菌效果的影響：在發酵溫度為28℃、180 r/min搖瓶培養，分別在第5～12天每天測定發酵液抑菌效果，每組做3個平行。

接種量對菌株F8抑菌效果的影響：在發酵溫度為28℃，接種量分別為5%、6%、7%、8%、9%、10%，180 r/min搖瓶培養11 d，測定發酵液抑菌活性，每組做3個平行。

發酵溫度對菌株F8抑菌效果的影響：在接種量為8%，發酵溫度分別為20℃、25℃、30℃、35℃條件下，180 r/min搖瓶培養11 d，測定發酵液抑菌活性，每組做3個平行。

發酵液的初始pH對菌株F8抑菌效果的影響：在接種量為8%，發酵溫度30℃，培養基初始pH分別為5、6、7、8、9條件下，180 r/min搖瓶培養11 d，測定發酵液抑菌活性，每組做3個平行。

1.3.5 抑菌活性物質穩定性研究

pH穩定性：將發酵液上清（10 000 r/min離心10 min）pH調節至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12放置1 h，然后再將pH調回到原發酵液pH，分別測定抑菌活性，每組做3個平行，以原發酵液作為對照。

熱穩定性：將發酵液上清分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃條件下水浴30 min，分別測定抑菌活性，每組做3個平行，以原發酵液作為對照。

光照穩定性：將發酵液上清置于光照條件下照射1～10 d，然后測定抑菌活性，以原發酵液作為對照。

遺傳穩定性：將菌株F8在高氏一號固體培養基連續傳代8代，然后每代分別進行搖瓶發酵（發酵液初始pH值為8，接種量8%，30℃條件下搖瓶發酵11 d），測定各代發酵液上清的抑菌效果。

1.3.6 抑菌物質的分離純化

將10 L發酵液10 000 r/min離心10 min取上清，然后旋轉蒸發得到發酵液浸膏，然后用盡量少的水溶解浸膏經過AB-8大孔樹脂層析，用體積分數分別為30%、50%、70%及100%的甲醇溶液梯度洗脫，收集甲醇流出液，旋轉蒸發至干，然后過鈉型732陽離子交換樹脂收集流出液，將流出液真空旋轉蒸發至干，將2.5 g濃縮樣品溶于2 mL超純水中，經葡聚糖凝膠G25柱層析得到抑菌活性物質粗提物。

1.3.7 粗提物最小抑菌濃度的測定

制備菌液：將指示菌預先活化兩代后再接種到液體培養基中，在37℃條件下培養6～8 h，作為測試菌菌液。

最小抑菌濃度（MIC）的測定：配制不同濃度的發酵液粗提物于試管中，在含不同濃度的粗提物試管中，各加入測試菌0.2 mL，充分混勻。另作兩個對照管（只含菌和只含粗提物）。將上述試管置37℃恒溫箱中培養24h。取出試管，充分振蕩，用肉眼逐個觀察各試管的渾濁度。如某管培養液與對照管（只含粗提物的試管）同樣透明，則表明測試菌的生長被抑制，因此該管的粗提物量即為MIC。

2 結果與分析

2.1 培養時間對抑菌效果的影響

圖1 不同培養時間對菌株F8抑菌活性的影響Fig.1 Effect of different culture time on antibacterial activity of strain F8

由圖1可知，隨著培養時間在5～11 d范圍內增加，發酵液對3種指示菌的抑制作用越來越強，說明隨著培養時間的增加產生的抑菌活性物質越來越多；當培養時間到第11天時抑菌作用達到最大，對金黃色葡萄球菌、產氣桿菌、變形桿菌的抑菌圈直徑分別為19 mm、29 mm、28 mm；當培養時間超過11d時，抑菌效果減小，原因可能是當培養天數超過一定值時，抑菌活性物質所處的發酵環境發生了變化導致活性物質降解，從而導致抑菌效果減小。因此，最適培養時間為11d。

2.2 接種量對抑菌效果的影響

圖2 不同接種量對菌株F8抑菌活性的影響Fig.2 Effect of different inoculum on antibacterial activity of strain F8

由圖2可知，隨著接種量在5%～8%范圍內增加，發酵液抑菌效果也隨著增加；當接種量為8%時抑菌效果達到最好，對金黃色葡萄球菌、產氣桿菌、變形桿菌的抑菌圈直徑分別為20 mm、32 mm、30 mm；當接種量＞8%之后，抑菌效果反而減小，原因可能是菌體生長所需要的氧氣、營養物質增加而三角瓶內的溶氧跟營養物質不能滿足其生長從而降低抑菌活性物質的生產使抑菌效果增加不明顯。因此，最適接種量為8%。

2.3 不同發酵溫度對抑菌效果的影響

圖3 不同培養溫度對菌株F8抑菌活性的影響Fig.3 Effect of different culture temperature on antibacterial activity of strain F8

由圖3可知，當發酵溫度在20～30℃范圍內升高，發酵液抑菌效果隨著溫度的增加而增大；當發酵溫度為30℃時，發酵液抑菌效果最好，對金黃色葡萄球菌、產氣桿菌、變形桿菌的抑菌圈直徑分別為22 mm、35 mm、32 mm；當發酵溫度高于30℃之后，發酵液抑菌效果降低，原因是當超過最適溫度以后菌株的生長狀況不好，所產的抑菌物質減少從而導致抑菌效果降低。因此，最適發酵溫度為30℃。

2.4 發酵液的初始pH對抑菌效果的影響

圖4 不同初始pH值對菌株F8抑菌活性的影響Fig.4 Effect of different initial pH values on antibacterial activity of strain F8

由圖4可知，隨著初始pH在5～8范圍內增加，抑菌效果隨之增加；當初始pH值為8時，抑菌效果達到最好，對金黃色葡萄球菌、產氣桿菌、變形桿菌的抑菌圈分別為23 mm、44 mm、34 mm；當初始pH值＞8之后，抑菌效果有所下降，原因是過酸或者過堿都不適合生長，所產的抑菌物質減少從而導致抑菌效果下降。因此，最適初始pH值為8。

2.5 抑菌活性物質的pH穩定性

由表1可知，經過不同pH處理菌株F8發酵產物對三種指示菌的抑制作用基本上沒有太大變化。結果表明，抑菌活性物質對酸堿有較強的承受能力，pH穩定性較好。

表1 菌株F8發酵產物抑菌活性的pH穩定性Table 1 pH stability of antibacterial activity of fermentation products produced by strain F8

2.6 抑菌活性物質的熱穩定性

表2 菌株F8發酵產物抑菌活性的熱穩定性Table 2 Thermal stability of antibacterial activity of fermentation products produced by strain F8

由表2可知，經過不同溫度處理發酵產物對三種指示菌的抑制作用基本上沒有太大變化。結果表明，菌株F8發酵所產抑菌活性物質具有很好的熱穩定性。

2.7 抑菌活性物質的光照穩定性

表3 菌株F8發酵產物抑菌活性的光照穩定性Table 3 Light stability of antibacterial activity of fermentation products produced by strain F8

續表

由表3可知，經過不同時間的光照處理，發酵產物對三種指示菌的抑制作用基本上沒有太大變化。結果表明，菌株F8發酵所產抑菌活性物質具有很好的光穩定性。

2.8 抑菌活性物質的遺傳穩定性

表4 菌株F8發酵產物抑菌活性的遺傳穩定性Table 4 Genetic stability of antibacterial activity of fermentation products produced by strain F8

由表4可知，不同傳代次數的菌株進行發酵，其發酵液對三種指示菌的抑制作用基本上沒有太大變化。結果表明，發酵產物的遺傳穩定性較好。

2.9 抑菌物質的分離純化

10 L發酵液經過旋轉蒸發濃縮，AB-8大孔樹脂層析，732陽離子交換樹脂層析，最后經葡聚糖凝膠G25層析進行分離純化，洗脫曲線見圖5。

圖5 發酵液組分在G25層析柱分離純化洗脫曲線Fig.5 Elution curve of separation and purification of fermentation liquid components on G25 chromatographic column

由圖5可知，一共洗脫出了4個峰，分別收集這4個峰對應的洗脫組分后進行抑菌試驗，結果表明，第3個峰對應組分的洗脫液具有抑菌效果。

2.10 最小抑菌濃度

將上述第3個峰洗脫液冷凍干燥后，配制成質量濃度分別為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60 μg/mL、70 μg/mL、80 μg/mL、90 μg/mL、100 μg/mL溶液進行MIC測試，以只含指示菌和只含粗提物兩支試管為對照，結果見表5。由表5可知，洗脫組分3對金黃色葡萄球菌的MIC為100 μg/mL，對變形桿菌的MIC為30 μg/mL，對產氣桿菌的MIC為20 μg/mL。

表5 抑菌活性物質粗提物對不同測試菌的最小抑菌濃度Table 5 Minimum inhibitory concentration of crude extracts of antibacterial active substances on different test bacteria

3 結論

本實驗對海洋鏈霉菌菌株F8進行了發酵條件的優化及其抑菌活性物質性質的研究。通過單因素實驗確定了菌株最佳發酵條件為培養時間11 d，接種量8%，培養溫度30℃，初始pH值為8。優化后菌株F8對金黃色葡萄球菌、產氣桿菌和變形桿菌的抑菌圈直徑分別為23 mm、44 mm、34mm。對菌株所產抑菌活性物質的性質進行了研究，發現抑菌活性物質為水溶性，并且具有較好的酸堿、熱、光照以及遺傳穩定性。在此基礎上通過AB-8大孔樹脂、鈉型732陽離子交換樹脂以及葡聚糖凝膠G-25層析對抑菌活性物質進行分析純化，并得到具有抑菌活性的粗提物，其對金黃色葡萄球菌、變形桿菌、產氣桿菌的MIC分別為100 μg/mL、30 μg/mL及20 μg/mL。